《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Bioinformatics-Guided structural characterization and immunogenicity assessment of multi-epitope vaccine candidates against Zika virus
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本研究针对寨卡病毒（ZIKV）这一重大全球健康威胁，采用生物信息学和基于软件的疫苗学方法，筛选出高抗原性的病毒蛋白（Pr、E、NS1），并从中鉴定出保守的T细胞和B细胞表位。研究人员构建了一种多表位疫苗（MEV），并通过计算分析证实其具有良好的抗原性、安全性、稳定性以及与人类TLR3受体的高亲和力，为开发有效的ZIKV疫苗奠定了坚实基础。
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种由蚊子传播的黄病毒，自1947年在乌干达的寨卡森林中首次从猴子体内发现以来，已对人类健康构成持续威胁。该病毒不仅可能引起寨卡热，导致约80%的感染者无症状或仅出现轻微发热，更严重的是，它还与新生儿小头畸形症和成人吉兰-巴雷综合征等严重神经系统并发症密切相关。2007年在雅浦群岛的暴发影响了超过70%的三岁以上人群，而2013年至2014年在法属波利尼西亚的疫情则感染了约三分之二的人口。自2015-2016年美洲疫情暴发以来，全球科研人员加速了针对ZIKV的有效疫苗研发工作。
然而，ZIKV疫苗的开发面临诸多挑战，其中病毒不同流行株之间的遗传变异性是关键障碍之一，这要求疫苗设计需要采取针对特定毒株的策略。近年来，生物信息学工具和计算算法的进步为疫苗设计带来了革命性的变化，使得研究人员能够以前所未有的准确性分析病毒蛋白结构、预测抗原表位并评估免疫原性。其中，多表位疫苗（Multi-Epitope Vaccine, MEV）作为一种有前景的策略，旨在针对特定的病毒靶点引发强大的免疫反应。研究表明，ZIKV的关键蛋白，如Pr蛋白、E蛋白（囊膜蛋白）和NS1（非结构蛋白1），在病毒入侵、复制和免疫逃逸机制中扮演着关键角色，并且含有能够刺激细胞免疫（T细胞）和体液免疫（B细胞）反应的表位，使其成为MEV设计的理想靶点。
在此背景下，发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》上的这项研究，假设通过生物信息学指导的设计，基于ZIKV的高抗原性和保守蛋白，可以开发出一种具有增强抗原性、广泛人群覆盖率和强大免疫原性的多表位疫苗候选物。该研究旨在鉴定最佳的T细胞和B细胞表位，构建包含适当佐剂和连接子的多表位疫苗，并利用全面的计算方法评估疫苗的理化特性、结构完整性、免疫原潜力以及与人类免疫受体的相互作用。
为开展研究，作者运用了多项关键生物信息学技术。首先，从BV-BRC数据库获取ZIKV毒株（如EU545988.1）的蛋白序列，利用VaxiJen、ANTIGENpro等服务器评估蛋白抗原性，并通过NetCTL 1.2和IEDB分析资源预测T细胞表位及其与MHC-I/II分子的结合亲和力。B细胞表位则使用BCPred、ABCpred等工具进行预测。随后，利用分子对接（如ClusPro 2.0、MDockPeP服务器）验证表位与免疫受体（如TLR3）的相互作用，并通过分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulation, MDS）评估复合物稳定性。疫苗构建后，使用Expasy ProtParam、VaxiJen、AllerTOP等工具分析其理化性质、抗原性、过敏原性和溶解度。二级和三级结构分别通过PSIPRED和同源建模/模型优化（如GalaxyWEB）进行预测和优化。最后，利用JCat服务器进行密码子优化，并使用SnapGene软件进行pET-28a(+)载体的大肠杆菌K12菌株体外克隆模拟。
研究结果
3.1. ZIKV高抗原性蛋白的鉴定
研究评估了ZIKV（EU545988.1）的所有蛋白，发现Pr蛋白、E蛋白和NS1蛋白的抗原性最高。其中，Pr蛋白的VaxiJen得分最高（0.6362），平均抗原性得分为0.714885，预测定位于宿主细胞膜、内质网和细胞核。E蛋白和NS1蛋白也显示出良好的抗原性。
3.2. 高感染性毒株的选择
通过对全球10种高感染性ZIKV毒株的分析，筛选出针对Pr、E、NS1蛋白抗原性最高的毒株，分别为Zika (USA, KU312312)、Rio-U1 (Brazil, KX601166)和Zika (Brazil, KU321639)，用于后续表位预测。
3.3. T细胞表位预测及其与MHC-I和II分子的结合亲和力
利用NetCTL 1.2服务器预测了Pr、E、NS1蛋白中的T细胞表位，并利用IEDB分析资源评估了它们与MHC-I和MHC-II分子的结合亲和力（IC50值）。筛选出结合亲和力高（MHC-I IC50≤ 250 nM, MHC-II IC50≤ 100 nM）的表位，如Pr蛋白中的HTCDATMSY、E蛋白中的VMIFLSTAV和NS1蛋白中的YHPDSPRRL等。
3.4. 分子对接验证
通过分子对接（MDockPeP服务器）验证了预测的T细胞表位与MHC-I和MHC-II分子的结合亲和力。结果显示，这些表位（如HTCDATMSY与HLA-A*01:01，ITScorePep: -146.2）能够稳定结合，支持其免疫原性潜力。
3.5. 过敏性、保守性、毒性和人群覆盖率评估
对预测的表位进行了过敏性（AllerTOP v2.0）、保守性（IEDB Conservancy tool）、毒性（ToxinPred）和人群覆盖率（IEDB population coverage tool）评估。关键表位如DLGHTCDATMSYECP（Pr）、ALGGVMIFLSTAVSA（E）和TSVWLKYHPDSPRRL（NS1）被鉴定为非过敏原、无毒、具有高保守性（95.24%-100%）和全球高人群覆盖率（71.88%-95.24%），组合覆盖率达98.27%。
3.6. B细胞表位预测与性能分析
使用BCPred、ABCpred等工具预测了线性B细胞表位，并通过BepiPred-2.0、SVMTrip等进行验证。获得了高SVMTriP得分（如1.000）的表位，如ATMSYECPMLDHVQI（Pr）、KDAHAKRQTVYVCKR（E）和RSMVTAEECPGTKVY（NS1）。使用IFNepitope服务器预测了MHC-II表位的干扰素-γ（IFN-γ）诱导能力，部分表位显示具有诱导IFN-γ反应的潜力。
3.7. 多表位疫苗（MEV）构建
将筛选出的最佳CTL、HTL和B细胞表位与适当的佐剂（IL-12，UniProt ID: P29459）和连接子（如EAAAK, AAY, GPGPG等）连接，并在C末端添加6XHis标签，构建了MEV序列。构建模式如图2所示。
3.8. MEV的理化特性、抗原性、过敏性、自身免疫性和溶解性分析
Expasy ProtParam分析显示MEV由434个氨基酸组成，分子量约为47956.07 Da，理论等电点（pI）为8.40，不稳定指数为57.37，总平均亲水性（GRAVY）为-0.628，表明其为亲水性蛋白。VaxiJen服务器预测其具有保护性抗原性（得分0.4328）。AllerTOP v. 2.0和Algpred预测其为非过敏原。Protein-sol服务器预测其具有可溶性。与人蛋白质组的BLAST比对未发现显著相似性，提示自身免疫风险低。
3.9. MEV的二级结构（2D）分析
使用SOPMA和PSIPRED服务器预测MEV的二级结构。SOPMA分析表明其由47.93%的α螺旋、13.59%的延伸链和38.48%的无规则卷曲组成。PSIPRED预测则显示38.43%的α螺旋和47.45%的β折叠。结果表明MEV具有以α螺旋为主的稳定构象。
3.10. 翻译后修饰（PTMs）分析
利用NetNGlyc-1.0、NetPhos-3.0等工具预测了MEV的翻译后修饰位点，包括5个N-糖基化位点、5个C-糖基化位点、51个磷酸化位点（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）和1个N-乙酰化位点，未预测到N端甘氨酸豆蔻酰化或GPI修饰。
3.11. 三级结构（3D）预测、模型优化、质量评估和拉曼图分析
使用服务器预测了MEV的三级结构，并通过GalaxyWEB进行优化。在五个优化模型中，模型3（MODEL 3）显示出最佳的全局结构比对（GDT-HA: 0.8854）、低RMSD（0.559）和良好的立体化学质量（MolProbity score: 1.729）。ProSA-web评估Z得分为-4.35，表明模型质量良好。拉曼图分析显示94.6%的残基位于最允许区域，结构合理。优化后的3D结构如图10所示。
3.12. 免疫模拟和构象性B细胞表位预测
使用C-IMMSIM服务器进行免疫模拟显示，MEV注射后能引起强烈的体液免疫和细胞免疫反应，包括IgM、IgG抗体滴度升高，以及B细胞、T细胞（包括细胞毒性T细胞TC和辅助性T细胞TH）、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞群体的动态变化和细胞因子/白细胞介素水平的振荡。使用ElliPro工具预测了MEV上的构象性B细胞表位，证实存在潜在的抗体结合位点。
3.13. 与人受体蛋白TLR3的分子对接
分子对接（ClusPro 2.0）表明MEV与人类Toll样受体3（TLR3, PDB: 7C76）具有高结合亲和力（所选模型能量得分-1239.7），界面面积大（1684 ?2），存在氢键和非键接触，表明二者可形成稳定的复合物，有助于激活先天免疫。
3.14. 分子动力学模拟（MDS）
对MEV-TLR3复合物进行100 ns的分子动力学模拟。RMSD分析显示平均值为3.32 ?，复合物在模拟后期趋于稳定。RMSF分析显示残基350-424区域灵活性较高。半径（RoG）分析表明复合物在约55 ns后结构变得更加紧凑并保持稳定，表明复合物结构稳定。
3.15. 密码子优化和体外克隆
使用JCat服务器对MEV序列进行密码子优化，使其适应大肠杆菌K12表达系统，密码子适应指数（CAI）为0.9708，GC含量为51.54%。优化后的序列成功体外克隆到pET-28a(+)载体中，最终构建体长约5317 bp。克隆图谱如图17所示。
结论与讨论
本研究通过综合的生物信息学方法，成功设计并评估了一种针对寨卡病毒的多表位疫苗。该疫苗基于抗原性高的ZIKV蛋白（Pr、E、NS1）的保守T细胞和B细胞表位构建，并辅以IL-12佐剂。全面的计算分析表明，该MEV候选物具有良好的抗原性、安全性（非过敏、无毒）、溶解性、结构稳定性，并能与人类先天免疫受体TLR3有效结合。免疫模拟预测其能引发强大的体液和细胞免疫反应。密码子优化和体外克隆证实了其在原核系统中表达的可行性。这些结果为后续的体外、体内实验验证和临床前研究奠定了坚实的基础，为开发安全有效的ZIKV疫苗提供了有希望的候选方案。与以往研究相比，本研究整合了更全面的毒株抗原性分析、表位筛选验证、结构模拟和免疫模拟，突出了其设计在广谱覆盖性和安全性方面的潜在优势。当然，疫苗的真正效力仍需通过湿实验进一步验证。
