《Advanced Science》：Elemene Augments the Effects of Anti-PD-1 Immunotherapy on Hepatocellular Carcinoma by Regulating the miR-130a-5p/SPP/MHC-I Axis
β-榄香烯增强抗PD-1免疫疗法对肝细胞癌疗效的机制研究
引言
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，超过三分之二的患者在确诊时已处于晚期，五年生存率低于15%。免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs），特别是程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂，已成为晚期HCC一线治疗的基石。然而，其总体缓解率仅为18%–20%，且面临免疫相关毒性及免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Immune Microenvironment, TIME）的双重挑战。联合疗法是克服这些局限的关键策略。近年来，中医药及其生物活性化合物在新药发现中展现出巨大潜力。β-榄香烯（Elemene）是从温郁金（Curcuma wenyujin）中提取的一种小分子萜类化合物（化学式C15H24），因其免疫调节潜力和在联合疗法中的临床疗效而备受关注。本研究旨在探讨β-榄香烯与抗PD-1免疫疗法在HCC治疗中的协同作用及其分子机制。
Elemene与抗PD-1联合疗法的协同抗HCC效应
为评估β-榄香烯联合抗PD-1（以下简称EP疗法）的治疗效果，研究团队在C57BL/6J小鼠中建立了原位和皮下异种移植两种HCC模型。治疗方案为每隔一天通过尾静脉注射β-榄香烯（50 mg kg-1），每周三次静脉注射抗PD-1抗体（100 μg mouse-1）。活体成像及切除肝脏的照片显示，单用β-榄香烯或抗PD-1仅能轻微延缓HCC进展，而EP疗法则表现出显著的抗肿瘤效果。重要的是，与对照组相比，各治疗组小鼠的体重、血清ALT指标以及肝、脾、肾的组织形态均未出现显著变化，表明EP疗法具有较低的系统毒性。在皮下异种移植模型中，EP疗法同样表现出协同抗肿瘤作用。免疫组织化学（IHC）分析显示，EP治疗后HCC样本中Ki-67阳性区域显著减少，而cleaved caspase-3阳性区域增加。生存分析进一步证实，EP疗法能显著延长原位HCC模型小鼠的生存时间。综上所述，EP疗法能协同抑制HCC进展且不引起明显的全身毒性。
EP疗法显著增强瘤内功能性CTLs的浸润
鉴于β-榄香烯已被报道具有免疫调节作用，且细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes, CTLs）的数量和功能状态是决定免疫疗法疗效的关键因素，研究者推测EP疗法可能对CTLs产生有利影响。通过流式细胞术分析瘤内淋巴细胞发现，与各单药治疗组相比，EP疗法处理后，皮下异种移植模型和原位HCC模型中CD45+CD3+细胞群中的CD8+T细胞和CD4+T细胞比例均显著增加，表明EP疗法能协同增加HCC组织中的CTLs数量。IHC结果与之吻合，EP治疗组小鼠的HCC组织显示出最强的CD8、干扰素-γ（IFN-γ）和颗粒酶B（Granzyme B）信号强度，提示CTLs的数量和细胞毒功能得到协同增强。此外，对原位HCC模型小鼠外周血样本的细胞因子阵列分析显示，EP治疗后，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IFN-γ等促炎细胞因子水平显著升高，表明EP疗法能促使整体免疫状态向免疫激活方向进行剧烈重塑。简言之，β-榄香烯与抗PD-1的联合能显著增加瘤内CTLs的浸润和功能。
Elemene通过上调SPP表达促进HCC细胞表面MHC-I/肽复合物的丰度和多样性
研究者假设，抗PD-1疗法在这些模型中作为主要的免疫治疗手段，而β-榄香烯则作为辅助性免疫调节剂重塑肿瘤微环境，从而增强CTL活性。由于肿瘤实质细胞是HCC微环境中最丰富的细胞类型，推测β-榄香烯可能影响HCC细胞免疫原性特征相关的关键蛋白。为验证此假设，对人源HCC细胞系Huh1和小鼠源HCC细胞系Hepa1c1c7进行了蛋白质质谱定量蛋白质组学分析。有趣的是，β-榄香烯处理后，两种HCC细胞系中信号肽肽酶（Signal Peptide Peptidase, SPP）的蛋白水平均显著上调。这一发现在其他HCC细胞系以及经过不同组合治疗的小鼠原位HCC模型中，通过蛋白质印迹（Western Blot）和定量聚合酶链反应（qPCR）得到了验证，证实β-榄香烯能有效诱导HCC细胞中SPP的表达。
现有证据表明，内质网蛋白酶SPP在抗原加工和呈递中起关键作用，沉默SPP会导致表面MHC-I/肽复合物数量普遍减少。因此，推测诱导SPP表达的β-榄香烯处理可增加HCC细胞表面MHC-I/肽复合物的丰度。流式细胞术检测MHC-I水平显示，β-榄香烯处理后细胞荧光信号峰右移，表明表面MHC-I水平增加。此外，对β-榄香烯处理后MHC-I抗体免疫沉淀物的质谱分析显示，≤12个氨基酸残基的独特短肽数量显著增加，表明抗原多样性显著提高。以上结果提示β-榄香烯能增加HCC细胞表面MHC-I/肽复合物的丰度和多样性。
为验证SPP是β-榄香烯诱导MHC-I/肽复合物增加的关键介质，研究者利用shRNA沉默HCC细胞中的SPP后，通过流式细胞术分析表面MHC-I水平。结果显示，在经SPP shRNA预处理的细胞中，β-榄香烯诱导的MHC-I荧光信号峰右移现象大大减弱。重要的是，原位HCC模型的IHC分析证实，SPP敲低有效消除了β-榄香烯诱导的MHC-I表达上调。这些结果表明，β-榄香烯诱导的表面MHC-I/肽复合物增加主要由SPP介导。
为探讨β-榄香烯是否能在临床HCC标本及其他类型癌细胞中诱导SPP/MHC-I轴，研究者用β-榄香烯处理了包括HCC、结直肠癌（CRC）、肝内胆管癌（ICC）和肺癌（LC）在内的多种癌症类型的患者来源类器官。IHC分析显示，β-榄香烯处理后，这些类器官中SPP和MHC-I的表达水平普遍升高，表明β-榄香烯诱导SPP/MHC-I轴在临床实践中的实体瘤中具有普遍性。上述结果证明，β-榄香烯通过增强SPP表达，进而增加HCC细胞表面MHC-I/肽复合物的丰度和多样性。
Elemene通过SPP/MHC-I轴增强CTLs克隆多样性与扩增
MHC-I/肽复合物与结构互补的T细胞受体（TCR）之间的识别是肿瘤特异性CTLs活化的初始步骤。膜表面MHC-I/肽复合物的丰度与多种实体瘤瘤内CTLs数量呈正相关。前述数据表明SPP是β-榄香烯诱导HCC细胞MHC-I增加的关键介质，但该轴与瘤内T细胞之间的关系仍需在体内进一步验证。
为此，研究者对皮下HCC异种移植模型的肿瘤组织进行了T细胞受体（TCR）测序。采用5' RACE协议进行无偏倚的TCR-β链扩增，并分析了V、D、J和C片段的组成。分析显示，与单药治疗相比，EP联合疗法显著增强了T细胞受体库的多样性，香农多样性指数（Shannon Diversity Index）在EP组显著增加。热图和3D森林图进一步可视化了受体库特征，显示治疗组，尤其是EP治疗后，V-J片段组合谱更广。此外，克隆频率分类分析以蜗牛图形式呈现，图中标为“1”的区域指“频率最低的独特T细胞克隆”。EP治疗组肿瘤中单克隆T细胞的频率最高，表明联合疗法增加了HCC中CTL的扩增潜力。总体而言，EP疗法比单用抗PD-1疗法产生了更高的CTL克隆多样性。
综上所述，β-榄香烯诱导的SPP/MHC-I轴可在免疫治疗期间增加瘤内CTLs的数量和多样性。然而，β-榄香烯诱导SPP表达的分子机制仍需进一步探究。
Elemene通过拮抗miR-130a-5p稳定SPP mRNA
评估SPP mRNA稳定性发现，在放线菌素D处理下，β-榄香烯延缓了SPP mRNA的降解。microRNAs（miRNAs）通过互补碱基配对介导mRNA降解。因此，推测β-榄香烯可能通过干扰miRNAs与SPP mRNA的结合来抑制其降解。为识别参与此过程的潜在miRNAs，在Hepa1-6细胞中进行了miRNA测序，发现216个miRNAs在β-榄香烯处理后显著下调。其中，66个miRNAs的表达水平与基于TCGA数据库的SPP mRNA水平呈负相关。碱基配对预测显示，26个miRNAs在ENCORI和TargetScan miRNA预测数据库中具有与SPP mRNA的潜在结合位点。最终，通过人和小鼠之间的保守性分析，将范围缩小至4个miRNAs。由于qPCR assay证实其在多个HCC细胞系中经β-榄香烯处理后均一下调，miR-130a-5p被选作进一步分析的对象。此外，经β-榄香烯处理的小鼠HCC组织中miR-130a-5p表达也显著低于未处理组。
为确定miR-130a-5p是否直接介导SPP mRNA降解，将SPP mRNA的3'非翻译区（3'UTR）插入荧光素酶报告质粒，并识别并删除了潜在的miR-130a-5p结合位点以构建突变体报告基因。双荧光素酶报告实验显示，miR-130a-5p模拟物处理使野生型（WT）3'UTR报告基因的荧光素酶活性降低40%，而相同处理仅使突变体报告基因活性降低4%，表明互补碱基配对对于miR-130a-5p诱导的SPP mRNA降解至关重要。
此外，薛定谔（Schr?dinger）分析显示，β-榄香烯通过范德华力和pi-烷基分子间相互作用与miR-130a-5p的沟槽结合，这种结合可能影响miRNA的功能，例如与SPP mRNA的结合。同时，进行SPP分子相互作用分析以测试miR-130a-5p与β-榄香烯之间跨分子相互作用的可能性，微量热泳动（MST）迹线曲线显示β-榄香烯与miR-130a-5p结合的解离常数（KD）为505.52 ± 43.039 μM，表明存在跨分子相互作用。此外，在重构的RISC复合体系统中外源性添加合成的miR-130a-5p模拟物，结果显示，与阴性对照（NC）相比，添加miR-130a-5p模拟物显著降低了SPP mRNA的表达水平。然而，与β-榄香烯共处理有效逆转了这种抑制。这些结果证明，β-榄香烯可在无细胞RISC复合体系统中直接拮抗miR-130a-5p介导的SPP mRNA降解。
为进一步研究miR-130a-5p是否介导β-榄香烯对SPP的调控，在存在miR-130a-5p抑制剂或模拟物的情况下用β-榄香烯处理HCC细胞。结果显示，miR-130a-5p模拟物可部分抵消β-榄香烯对SPP mRNA的保护作用，而miR-130a-5p抑制剂则逆转了β-榄香烯对SPP mRNA降解的影响。因此，这些数据表明miR-130a-5p是介导β-榄香烯对SPP mRNA保护作用的关键因子。上述数据证明，β-榄香烯通过抑制miR-130a-5p介导的SPP mRNA降解来诱导SPP/MHC-I轴。
miR-130a-5p/SPP/MHC-I信号轴在HCC免疫微环境中的关键作用
为阐明miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴在TIME调控中的作用，给携带Hepa1-6-shscramble和Hepa1-6-shSPP异种移植瘤的小鼠注射miR-130a-5p拮抗剂（antagomir）。肿瘤体积生长曲线显示，Hepa1-6-shSPP异种移植瘤的生长速度快于Hepa1-6-shscramble异种移植瘤，瘤内注射miR-130a-5p拮抗剂导致Hepa1-6-shscramble异种移植瘤体积显著减小，但相同处理对Hepa1-6-shSPP异种移植瘤无效。实验结束时解剖的肿瘤重量也观察到类似趋势。此外，HCC样本的IHC分析显示，与对照组相比，miR-130a-5p拮抗剂降低了Hepa1-6-shscramble异种移植瘤中Ki-67的信号强度，而Hepa1-6-shSPP异种移植瘤中Ki-67信号强度无显著变化。cleaved caspase-3的IHC模式与Ki-67相反，与异种移植瘤生长曲线一致。
此外，对异种移植组织进行流式细胞术分析总T细胞群中CTLs和CD4+T细胞的比例。结果显示，miR-130a-5p拮抗剂显著增加了Hepa1-6-shscramble异种移植瘤中CTLs和CD4+T细胞的比例，但对Hepa1-6-shSPP异种移植瘤无明显影响。类似地，IHC assay结果显示，经miR-130a-5p拮抗剂处理的Hepa1-6-shscramble异种移植瘤呈现出最强的SPP、MHC-I和CD8信号强度，与流式细胞术结果一致。这些发现表明，miR-130a-5p拮抗剂以SPP依赖的方式逆转了免疫抑制性TIME。
根据之前的实验结果，SPP水平升高会增加HCC细胞表面MHC-I/肽复合物的丰度，因此预计miR-130a-5p表达会降低MHC-I/肽复合物的丰度。于是，在存在或不存在miR-130a-5p抑制剂的情况下，通过流式细胞术分析了Hepa1-6-shscramble和Hepa1-6-shSPP细胞中膜MHC-I的丰度。结果显示，miR-130a-5p抑制剂增强了Hepa1-6-shscramble细胞的MHC-I荧光信号强度，但这种增强在Hepa1-6-shSPP细胞中减弱，表明miR-130a-5p可通过SPP调控膜MHC-I的丰度。为测试靶向该轴对于增强MHC-I丰度的充分性，研究者使用了现有的体内模型，单独使用miR-130a-5p拮抗剂。结果显示，miR-130a-5p拮抗剂增强了Hepa1-6-shscramble肿瘤的MHC-I荧光信号强度，但这种增强在Hepa1-6-shSPP肿瘤中减弱，表明miR-130a-5p主要通过SPP调控膜MHC-I的丰度。
为确定该轴的功能是否依赖于SPP作为蛋白酶的酶活性，在SPP敲低细胞中重建了野生型SPP（SPP-WT）或酶活性无效突变体（SPP-D265A）。MHC-I表达的定量分析和代表性流式细胞术直方图显示，miR-130a-5p抑制剂不能逆转由SPP敲低引起的MHC-I丰度损失，而重建SPP-WT后MHC-I丰度显著增加，但催化死亡的SPP-D265A突变体则无此效果。这一结果明确证明miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴以严格依赖SPP切割活性的方式运作。这些数据表明miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴在调控HCC的TIME中起关键作用。
基于所有这些结果，可以得出结论：在增强CD8+T细胞反应的同时，β-榄香烯治疗显著增加了TME内CD4+辅助性T细胞的浸润。这种T细胞亚群的协同激活表明β-榄香烯促进了全面的抗肿瘤免疫反应。
SPP与HCC中激活的免疫微环境相关
为将机制研究发现转化为临床相关性，研究者调查了SPP与人类HCC队列中肿瘤免疫微环境之间的关联。对60例HCC样本队列的分析通过IHC证实了SPP与CD8蛋白水平呈正相关。多重免疫荧光进一步证明了SPP、MHC-I和CD8+T细胞在肿瘤巢内的空间共定位，将SPP表达细胞定位于免疫学活跃的背景下。
TCGA-LIHC队列的转录组学分析显示，SPP表达与多种免疫细胞类型浸润增加相关，包括CD8+T细胞和CD4+T细胞。此外，SPP表达与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性显著相关，通过CYT评分（GZMA和PRF1表达水平的几何平均数）量化。然而，与癌旁正常肝组织相比，这种相关性在HCC肿瘤中显著减弱，表明在肝癌发生过程中SPP-CTL功能轴失调。
当分析MHC-I介导的抗原呈递通路时，正常肝组织和恶性肝组织之间出现了更显著的差异。SPP表达与正常肝组织中整体通路活性（ssGSEA评分）呈强正相关，但这种关联在HCC肿瘤中几乎消失。这种相关性减弱的模式延伸至MHC-I机制中的各个关键组件。热图总结显示，在正常肝组织中观察到的几乎所有MHC-I通路基因的强相关性在HCC组织中均一致减弱。这一发现表明在肿瘤发生过程中SPP-MHC-I调控网络逐渐瓦解，可能反映了逃避抗肿瘤免疫的适应性机制。
尽管与MHC-I通路解耦，SPP高表达肿瘤仍保留独特的免疫原性特征。具体而言，它们与多种免疫检查点基因的表达呈显著正相关，包括PDCD1（PD-1）、CTLA4和LAG3。总的来说，这一特征定义了一种经典的适应性免疫抵抗状态，其特征是保留的T细胞浸润、残余的细胞溶解活性，同时上调的抑制性检查点以及被破坏的SPP-MHC-I抗原呈递轴。在这种情况下，尽管存在效应T细胞，肿瘤仍能逃避免疫介导的破坏。重要的是，我们的临床前数据支持β-榄香烯疗法可以通过有效上调SPP蛋白水平来克服这种耐药性，从而重建功能性的MHC-I介导的抗原呈递，进而创造可被检查点阻断利用的治疗脆弱性。这些临床观察增强了靶向SPP轴以使HCC对免疫治疗增敏的转化潜力。
讨论
本研究发现，β-榄香烯与抗PD-1联合疗法具有协同抗HCC作用，并阐明了miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴在β-榄香烯诱导的TIME再激活中的作用。初步毒性分析表明该联合用药方案安全性良好，具有较高的临床转化潜力。
免疫疗法，尤其是靶向PD-1/PD-L1的ICIs，在过去二十年改变了癌症治疗的格局。然而，随着药物用量的稳步增加，免疫相关不良事件（irAEs）的报道也随之出现。因此，许多研究小组致力于通过纳米技术介导的肿瘤靶向递送策略来降低抗PD-1/PD-L1抗体的全身毒性。作为一种小分子量（204.35）的萜类化合物，纯β-榄香烯是一种挥发性液体，但可在临床制剂中通过脂质体包裹来解决此问题。β-榄香烯脂质体常作为单药或与放疗和化疗联合用于恶性肿瘤的治疗。由于我们的研究表明分别给药时β-榄香烯和抗PD-1表现出协同抗HCC效应，我们推测具有抗PD-1表面修饰的复合β-榄香烯脂质体可能具有更强的协同功效。
CTLs是当前癌症免疫治疗的焦点，但最近的研究揭示，更多类型的细胞，如NK细胞和巨噬细胞，也是癌症免疫治疗的有希望的靶点。我们的研究阐明了β-榄香烯通过miR-130a-5p/SPP轴介导的多层免疫调节机制。我们证明，在SPP表达完整的肿瘤中，miR-130a-5p拮抗剂治疗显著增强了CD8+T细胞、CD62L+中央记忆T细胞、NK1.1+自然杀伤细胞和CD11c+树突状细胞的肿瘤浸润，而这些效应在SPP敲低肿瘤中被完全消除。这些发现不仅确立了miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴在β-榄香烯作用中的关键地位，也为基于多靶点协同的癌症免疫治疗提供了新的理论框架。
蛋白酶SPP在我们的研究中被确定为β-榄香烯免疫激活功能的关键介质，SPP的缺失与HCC细胞中膜肽/MHC-I复合物减少导致的抑制性TIME相关。除HCC外，我们对患者来源类器官的初步研究也揭示，β-榄香烯诱导的SPP表达可能以类似方式影响其他类型实体瘤中的肽/MHC-I复合物。然而，一些研究表明，SPP可能根据癌症类型的不同扮演肿瘤抑制或致癌角色。因此，尽管β-榄香烯在多种癌细胞中表现出抗增殖作用，但我们关于β-榄香烯与抗PD-1协同用于HCC免疫治疗的发现不应直接应用于其他类型的癌症，其药物相互作用的生物学机制可能不局限于miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴。
我们对人类HCC队列的分析揭示了一个关键的病理生理学见解：SPP高表达的肿瘤微环境存在于一种功能性解耦状态。虽然它在空间上为免疫接触而构建并且广泛炎症，但SPP与CTL细胞毒性及MHC-I抗原呈递通路之间的关键功能联系在肿瘤中相较于正常肝脏特异性减弱。这表明HCC细胞已经发生了功能适应性，以破坏SPP本应协调的效应器功能。在此背景下，β-榄香烯的作用是重建这个失效的SPP-MHC-I功能轴，从而将功能失调的免疫识别状态转化为富有成效的免疫警报状态，并创造我们观察到的对检查点阻断的脆弱性。
我们对miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴的阐明不仅为β-榄香烯诱导的免疫原性提供了机制见解，也为HCC揭示了可操作的治疗策略。从病理生理学角度来看，MHC-I的下调是人类HCC中一种有据可查的免疫逃避机制，通常与对ICI的不良反应相关。我们的研究结果表明，使用miR-130a-5p拮抗剂靶向该轴可以恢复MHC-I介导的抗原呈递，并将免疫“冷”肿瘤转化为免疫“热”表型，从而扩大适合ICI治疗的患者群体。总体而言，我们发现β-榄香烯通过调控miR-130a-5p/SPP/MHC-I轴来增强抗PD-1免疫疗法对HCC的疗效。具体而言，β-榄香烯通过促进抗原呈递重新激活TIME，从而与抗PD-1表现出协同抗HCC效应。因此，β-
