《Advanced Science》：Structural and Functional Characterization of EXPO-Derived Extracellular Vesicles in Plants
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本综述系统阐述了植物胞外囊泡（EVs）的异质性、生物发生途径及其在免疫应答中的功能。作者通过三维电子断层扫描（3D ET）、冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）及免疫金标记透射电镜等技术，首次在植物中明确区分TET8阳性小EVs（50–200 nm）、Exo70E2阳性中EVs（200–500 nm）和PEN1阳性大EVs/胞外管状结构（500–2000 nm），并证实EXPO（外泌体阳性细胞器）来源的EVs通过递送防御相关蛋白增强植物对病原体（如Pst DC3000）的抗性。研究为植物EVs的分类与功能研究提供了超微结构证据和分子机制框架。
1 引言
植物胞外囊泡作为细胞间通讯的重要载体，其生物发生机制、异质性及膜起源尚未明确。经典分泌途径（CPS）依赖内质网-高尔基体运输，而非经典分泌途径（UPS）则涉及无信号肽蛋白的胞外释放，其中EVs介导的运输是UPS的关键形式。早期研究通过化学固定和二维透射电镜在植物病原互作场景中观察到EV样结构，但生理状态下EVs的起源与多样性仍待解析。
2 结果
2.1 不同植物细胞类型中EVs的鉴定
通过高压冷冻-冷冻替代（HPF/FS）技术结合三维电子断层扫描（3D ET），在拟南芥根边缘细胞中鉴定出三类EVs：
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TET8阳性小EVs（直径50–200 nm），无核糖体内容物；
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Exo70E2阳性中EVs（直径200–500 nm），内含核糖体，起源于双膜结构EXPO，通过外膜与质膜（PM）融合释放；
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PEN1阳性大EVs/胞外管状结构（直径500–2000 nm），含核糖体与小囊泡，可能通过质膜出芽形成。
在保卫细胞和花粉管中均观察到类似EV亚群，且冷冻ET证实其近天然状态结构与室温ET结果一致。
2.2 冷冻ET提供植物EVs的近天然证据
通过 plunge-freezing 与聚焦离子束（FIB）铣削制备花粉管冷冻薄层，冷冻ET显示花粉管胞外区存在与室温ET结构吻合的小EVs（30–100 nm）。利用SOLIST lift-out技术从高压冷冻花粉颗粒中提取样本，进一步验证胞外管状结构的真实性。
2.3 不同尺寸EVs的分子标记定位
转基因拟南芥中，TET8-GFP定位于多泡体（MVBs）标志蛋白ARA6的区室，PEN1与trans-高尔基网络（SYP61）共定位，而Exo70E2独立于MVB和高尔基体，专一标记EXPO。免疫金TEM显示：
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76%中EVs为Exo70E2阳性；
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87%小EVs为TET8阳性；
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PEN1阳性信号富集于大EVs及花粉颗粒胞外管状结构。
2.4 EXPO来源EVs参与植物应激响应
通过蔗糖梯度离心与免疫分离技术从Exo70E2-GFP转基因细胞中纯化EXPO，蛋白质组学鉴定出217种EXPO相关蛋白，包括应激响应蛋白（如PHB2、SLY1）和病原防御相关蛋白BSP（AT2G15130）。剪接体AT2G15130.2与Exo70E2共定位，提示异构体可能通过不同途径分泌。
在exo70e2突变体中，病原响应基因（PR1、ATG8a等）表达下调，而Exo70E2过表达株系对Pst DC3000抗性增强。ET分析显示exo70e2过表达株系根边缘细胞中EXPO来源EVs数量显著增加，表明EXPO-EVs通过递送防御蛋白参与免疫。
3 讨论
本研究通过多维成像技术明确了植物EVs的三类亚群，提出EXPO-EVs是植物特有的分泌器官。EVs可能通过细胞壁修饰酶软化壁层或借助壁孔隙穿越细胞壁，其在根毛、花粉管等组织的富集暗示其功能多样性：如根边缘细胞EVs参与细胞壁增厚，花粉颗粒中EVs降解后融入内壁。EXPO-EVs的脂质组可能富含内质网特征磷脂（如磷脂酰胆碱），而大EVs则富含甾醇与鞘脂，但其脂质组成仍需靶向验证。与动物外泌体相比，植物TET8-EVs虽与MVB-PM融合相关，但融合事件在静态ET中难以捕捉，需结合活细胞成像进一步验证。
4 实验方法
研究利用转基因株系（Exo70E2-GFP、TET8-GFP、GFP-PEN1）进行免疫金TEM、CLEM及冷冻ET分析；通过蔗糖梯度离心与抗体偶联磁珠分离EXPO，结合LC-MS/MS鉴定 cargo 蛋白；病原接种实验采用喷雾法接种Pst DC3000，并通过菌落计数（CFU）评估抗性；RNA测序与qPCR分析exo70e2突变体转录组变化。
