《Advanced Science》：Targeting Peptostreptococcus anaerobius with an Iron-Based Nanozyme Reverses Ferroptosis Resistance and Enhances Antitumor Immunity in Colorectal Cancer
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本研究开发了一种负载林可霉素的铁基纳米酶(Linco@Fe-zyme)，通过精准清除肿瘤内厌氧消化链球菌并利用其过氧化物酶样活性诱导铁死亡，有效逆转结直肠癌的铁死亡抵抗。该策略同时通过损伤相关分子模式(DAMPs)释放引发免疫原性细胞死亡(ICD)，促进树突状细胞(DC)成熟和T细胞活化，实现协同抗肿瘤效果。
1 引言
结直肠癌(CRC)是全球高发恶性肿瘤，尽管在早期检测、手术技术和系统治疗方面取得进展，但晚期患者预后仍不理想。铁死亡作为一种铁依赖性调节性细胞死亡方式，因其在癌症治疗中的潜力而受到关注。研究发现，肿瘤内微生物群在结直肠癌治疗结局中起关键作用，其中厌氧消化链球菌(P. anaerobius)通过产生色氨酸代谢产物吲哚-3-丙烯酸(IDA)抑制铁死亡，促进肿瘤进展。
2.1 P. anaerobius在结直肠癌中富集并通过抑制铁死亡促进肿瘤进展
通过对25对结直肠癌患者肿瘤和癌旁组织的16S rRNA测序分析，发现肿瘤组织中P. anaerobius显著富集。在动物模型中，给予P. anaerobius处理的小鼠肿瘤生长明显加速，肿瘤重量显著增加。体外实验表明，P. anaerobius促进结直肠癌细胞迁移、侵袭和增殖。
机制研究发现，P. anaerobius及其代谢产物IDA通过激活芳基烃受体(AHR)抑制铁死亡，表现为酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)表达下调，而谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁死亡抑制蛋白1(FSP1)表达上调。脂质过氧化产物4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)和丙二醛(MDA)水平降低，C11-BODIPY荧光分析也证实脂质过氧化水平下降。
2.2 针对P. anaerobius的抗肿瘤活性抗生素筛选
通过最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定，从多种抗生素中筛选出林可霉素(Linco)和替硝唑(TNZ)对P. anaerobius具有最佳杀菌活性。体内实验显示，林可霉素处理能有效消除P. anaerobius，逆转其对铁死亡的抑制作用，显著抑制肿瘤生长。
2.3 靶向林可霉素递送的理论基础及Linco@Fe-zyme的合成
采用吸附-煅烧策略合成了一种Fe-N-C基异质纳米酶复合材料，用于封装林可霉素(称为Linco@Fe-zyme)。该纳米酶呈球形形态，主要粒径约为110纳米，具有介孔结构，孔径分布峰值约为13纳米。表征结果显示材料中存在铁单原子(Fe SA)和铁原子簇(Fe AC)两种活性中心。
该纳米酶表现出显著的过氧化物酶(POD)样活性，在弱酸性条件下能有效催化过氧化氢(H2O2)分解产生羟基自由基。药物负载实验显示，Linco@Fe-zyme的包封效率为81.41%，载药量为6.31%，且在酸性环境中具有更快的药物释放速率。
2.4 Linco@Fe-zyme诱导铁死亡和抗肿瘤功效的体外评价
体外实验证实，Linco@Fe-zyme能有效清除P. anaerobius，并通过其POD样活性促进活性氧(ROS)生成，增强铁死亡信号。Western blot和qPCR分析显示，Linco@Fe-zyme处理显著上调铁死亡相关标志物表达。透射电镜观察发现，处理组细胞出现线粒体皱缩和嵴坍塌等铁死亡特征性变化。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)掺入实验和CCK-8检测表明，Linco@Fe-zyme有效抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞死亡。
2.5 Linco@Fe-zyme诱导树突状细胞成熟的体外验证
铁死亡的肿瘤细胞释放大量损伤相关分子模式(DAMPs)，包括高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的胞外释放、钙网蛋白(CRT)的上调和胞质重定位以及ATP的泄漏。与骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)共培养实验显示，Linco@Fe-zyme处理组中CD80+和CD86+成熟树突状细胞比例显著增加，表明其能有效激活抗肿瘤免疫应答。
2.6 Linco@Fe-zyme诱导铁死亡和抗肿瘤功效的体内验证
在荷瘤小鼠模型中，Linco@Fe-zyme处理展现出最佳的抗肿瘤效果，肿瘤体积和重量显著减小。组织学分析显示，治疗组肿瘤细胞死亡增加，铁死亡标志物ACSL4表达上调，GPX4和FSP1表达下调。血液生化参数和主要器官组织学检查未发现明显毒性反应，表明该纳米酶具有良好的生物安全性。
2.7 微生物和代谢组学分析揭示Linco@Fe-zyme逆转铁死亡的机制
16S rRNA测序显示，Linco@Fe-zyme处理显著降低肿瘤内P. anaerobius的相对丰度。代谢组学分析发现，P. anaerobius暴露增加了多种微生物代谢产物水平，而Linco@Fe-zyme处理则显著降低这些代谢物。KEGG通路富集分析表明，受影响代谢物主要参与谷氨酰胺代谢通路。IDA水平在P. anaerobius组显著升高，而在Linco@Fe-zyme处理后明显降低。
免疫应答评估显示，Linco@Fe-zyme处理促进树突状细胞成熟，增加脾脏和肿瘤组织中CD3+CD4+记忆T细胞和CD3+CD8+效应T细胞比例，增强抗肿瘤免疫反应。
3 结论
本研究成功构建了一种负载林可霉素的铁基纳米酶递送系统，通过精准清除肿瘤内厌氧消化链球菌和诱导铁死亡的双重机制，有效抑制结直肠癌进展。该策略同时通过免疫原性细胞死亡激活抗肿瘤免疫应答，为结直肠癌治疗提供了新的微生物群靶向治疗思路。
4 实验方法
研究采用临床结直肠癌患者样本进行16S rRNA测序和代谢组学分析。体外实验使用LoVo和MC38结直肠癌细胞系，通过Transwell实验、伤口愈合实验、CCK-8检测等方法评估细胞行为。动物实验建立皮下异种移植模型和AOM/DSS诱导的原位结直肠癌模型。纳米酶表征包括扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、X射线光电子能谱(XPS)等多种技术。统计分析使用RStudio和GraphPad Prism软件进行。
