N端乙酰化调控α-突触核蛋白高亲和力Cu(I)配位结构的分子机制研究

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Impact of N-terminal acetylation on Cu(I) coordination by alpha synuclein protein

本研究通过X射线吸收光谱与电子结构计算，揭示了N端乙酰化修饰如何精细调控帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白（AS）与一价铜离子（Cu(I)）在其高亲和力结合位点的配位结构。研究人员发现乙酰化通过将第四配体从N端氨基转变为乙酰基羰基氧，形成更灵活的2S2O配位模式，显著影响AS的构象稳定性与氧化还原特性，为理解铜离子稳态失调在神经退行性疾病中的作用提供了关键分子见解。

　　

在探索帕金森病（Parkinson's disease, PD）发病机制的过程中，科学家们逐渐将目光聚焦于一种名为α-突触核蛋白（alpha-synuclein, AS）的微小蛋白质。这种由140个氨基酸组成的蛋白质，在健康的大脑中扮演着重要角色，主要负责神经递质囊泡的摄取、储存和回收，堪称神经通讯的“调度员”。然而，当AS蛋白发生错误折叠并聚集形成不溶性的淀粉样纤维时，便会成为帕金森病的典型病理标志——路易体（Lewy bodies）的核心成分。这种病理变化导致多巴胺能神经元逐渐死亡，进而引发震颤、僵硬、运动迟缓等一系列运动障碍症状。

除了遗传因素和环境毒素暴露，金属离子代谢异常也被认为是帕金森病的重要诱因之一。其中，铜离子（Cu）因其在氧化应激反应中的关键作用而备受关注。人体内的铜主要以两种氧化态存在：二价铜（Cu(II)）和一价铜（Cu(I)）。值得注意的是，在细胞内的还原性环境中，Cu(I)是主要存在形式。AS蛋白拥有三个独立的铜结合位点，而位于其N末端（第1-5位氨基酸）的区域对铜离子具有最高的亲和力。更复杂的是，在人体内，超过80%的AS蛋白会发生一种名为N端乙酰化（N-terminal acetylation）的翻译后修饰，即在蛋白质N末端的氨基上添加一个乙酰基。这种修饰如同给蛋白质戴上了一顶“帽子”，会显著改变其结构特性：增强螺旋性、提高与脂质囊泡的结合能力，并调制其铜结合特性。

早前研究已知，乙酰化会抑制Cu(II)在AS蛋白N端高亲和力位点的结合，但却能增强Cu(I)的结合亲和力。然而，乙酰化究竟如何精确影响Cu(I)在分子水平上的配位环境，这一直是个未解之谜。理解这一微观细节至关重要，因为Cu(I)与AS的相互作用被认为可能通过催化氧化反应，加剧AS的异常聚集，从而推动帕金森病的病理进程。为了揭开这一谜团，由Trinidad Arcos-López、Hyeongtaek Lim等多国学者组成的研究团队，在《Journal of Inorganic Biochemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们综合运用先进的X射线吸收光谱（XAS）技术和电子结构计算，首次在原子尺度上解析了乙酰化修饰对AS蛋白N端高亲和力Cu(I)结合位点几何结构的深刻影响。

为了精准解析Cu(I)的配位结构，研究人员运用了几项关键技术。首先，他们通过分子生物学手段制备了研究所需的蛋白质和肽段样品：包括使用H50A点突变（将第50位的组氨酸突变为丙氨酸）的AS全长蛋白（ASH50A）及其乙酰化形式（AcASH50A），以排除His50位点对N端位点研究的干扰；同时合成了模拟N端前6个氨基酸（MDVFMK序列）的肽段模型（AS(1-6)）及其乙酰化形式（AcAS(1-6)），并进一步合成了将甲硫氨酸（Met）替换为异亮氨酸（Ile）的变体（M1I和M5I），以验证Met1和Met5在配位中的具体作用。核心分析技术是X射线吸收光谱，具体包括X射线吸收近边结构（XANES）和扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）谱学分析。这些技术如同给铜离子拍摄“X光片”，能够精确测量其周围邻近原子的种类、数量和距离。实验在斯坦福同步辐射光源（SSRL）的低温条件下（约10K）进行，以确保数据质量。此外，团队还进行了深入的密度泛函理论（Density Functional Theory, DFT）计算，利用OPBE泛函和TZVP基组，对一系列可能的Cu(I)-肽段复合物模型进行几何优化和能量计算，并将理论计算得到的金属-配体键长与EXAFS实验数据反复比对，以确定最合理的配位模式。

3.1 Cu(I)与未乙酰化α-突触核蛋白N端区域的配位

3.1.1 Cu(I)-ASH50A和Cu(I)-AS(1-6)复合物的XAS研究

研究发现，Cu(I)与ASH50A蛋白以及AS(1-6)肽段复合物的XANES和EXAFS图谱几乎完全相同，表明AS(1-6)肽段能够很好地模拟全长蛋白N端的Cu(I)结合位点。XANES谱在8984 eV处的强烈信号，以及EXAFS数据的最佳拟合结果，均支持一个四配位的Cu(I)配位环境，包含两个硫原子（来自Met1和Met5）和两个氧/氮原子作为配体。平均键长为2个Cu-S键约2.35 ?，2个Cu-O/N键约2.12-2.16 ?。通过研究Met变体肽段（M1I和M5I），证实了两个甲硫氨酸残基对于形成正确的Cu(I)配位结构都是不可或缺的。缺乏任何一个Met都会导致配位模式改变，光谱特征显著不同，尤其是缺失Met1会使得Cu(II)还原不完全，表明Met1在稳定Cu(I)方面起着至关重要的作用。

3.1.2 Cu(I)与未乙酰化α-突触核蛋白N端位点结合的DFT建模

DFT计算进一步揭示了未乙酰化AS中Cu(I)的精确配位模式。在考察的多种模型中，能量最低且与EXAFS数据吻合最好的模型是2SN_termO_COO。该模型显示，Cu(I)与Met1和Met5的硫原子、N末端氨基的氮原子（N_term）以及Asp2侧链羧基的一个氧原子（O_COO）配位。计算得到的键长（2个Cu-S平均2.33 ?，2个Cu-O/N平均2.12 ?）与实验值高度一致。该配位模式形成了一个相对刚性的结构，其中在Met1的硫原子和N末端氨基氮原子之间形成了一个6元环。

3.2 Cu(I)与乙酰化α-突触核蛋白N端区域的配位

3.2.1 Cu(I)-AcASH50A和Cu(I)-AcAS(1-6)复合物的XAS

对于乙酰化蛋白，研究发现即使起始的Cu(II)是结合在蛋白的C端区域（因为乙酰化抑制了Cu(II)在N端的结合），还原后生成的Cu(I)依然会迁移到N端的高亲和力位点。Cu(I)-AcASH50A和Cu(I)-AcAS(1-6)的光谱特征极为相似，表明肽段模型的有效性。EXAFS拟合同样支持一个四配位的2S2O/N配位环境，平均键长为2个Cu-S键约2.36-2.37 ?，2个Cu-O/N键约2.15-2.16 ?。与未乙酰化形式相比，乙酰化Cu(I)复合物的EXAFS信号强度有所差异，提示配位微环境发生了变化。

3.2.2 Cu(I)与乙酰化α-突触核蛋白N端位点结合的DFT建模

DFT计算为乙酰化带来的变化提供了分子层面的解释。对于乙酰化形式，最稳定的模型是2SO_COOO_Ac。由于N末端氨基被乙酰化，氮原子不再参与配位，取而代之的是乙酰基上的羰基氧原子（O_Ac）。因此，Cu(I)与Met1和Met5的硫原子、Asp2的羧基氧原子（O_COO）以及N末端乙酰基的羰基氧原子（O_Ac）配位。该模型的计算键长（2个Cu-S平均2.34 ?，2个Cu-O平均2.13 ?）与实验值吻合良好。一个关键的结构变化是，乙酰化后，配位环的大小从Met1硫原子到N端配体之间的6元环扩大到了8元环，这赋予了复合物更大的灵活性。

本研究通过精密的实验测量与理论计算相结合，清晰地揭示了N端乙酰化对α-突触核蛋白高亲和力Cu(I)结合位点的调控机制。核心结论在于，尽管乙酰化与未乙酰化的AS蛋白均以Met1和Met5的硫原子作为主要锚定点，为Cu(I)提供四配位的2S2O环境，但关键的差异在于第四配体的身份：未乙酰化AS利用其N末端氨基的氮原子，而乙酰化AS则利用其新引入的乙酰基上的羰基氧原子。这一看似微小的化学变化，却引发了显著的构象和电子结构改变。乙酰化导致的配位环扩大增加了Cu(I)结合位点的灵活性。更重要的是，这种配位模式的转变与Cu(I)结合亲和力的轻微提高以及氧化还原电位的显著正移（从142 mV升至400 mV vs. NHE）密切相关。更高的氧化还原电位意味着Cu(I)-AcAS复合物更易被氧化，可能具有更高的氧化还原反应活性，这为理解铜离子介导的AS氧化修饰和聚集提供了新的分子基础。此外，研究还计算了从Cu(II)-AS还原至Cu(I)-AS过程中的分子内重组能（λ_AS），发现乙酰化虽引起结构重组，但其重组能（λ_AcAS）并未异常增大，部分原因可能是乙酰化本身诱导的N端α-螺旋构象预组织了配体，利于Cu(I)结合。综上所述，这项工作不仅精确解析了生理相关（乙酰化）状态下AS蛋白与Cu(I)的配位化学，强调了翻译后修饰在调控金属-蛋白质相互作用中的精细作用，更重要的是，它将AS的构象变化、铜结合特性与帕金森病的潜在病理机制（如氧化应激）更紧密地联系起来，为未来开发针对金属信号通路的新型干预策略提供了重要的理论依据。