新型尼克酰胺席夫碱作为JAK1/CDK7双靶点抗癌剂的开发与研究

《Scientific Reports》：Novel niclosamide-derived Schiff bases as a dual-targeted anticancer agents

本研究针对尼克酰胺（NIC）作为抗癌药物存在的药代动力学缺陷，设计合成了13种新型尼克酰胺衍生的席夫碱化合物。通过体外活性筛选发现，化合物8和11对乳腺癌（MCF-7, MDA-MB-231）和前列腺癌（PC-3）细胞表现出强效选择性细胞毒性，其作用机制涉及双重抑制JAK1和CDK7激酶活性，并能有效诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。该研究为克服NIC的临床应用局限性提供了新型先导化合物，在双靶点抗癌药物开发方面具有重要意义。

　　

癌症治疗领域一直面临着现有药物疗效不足、耐药性产生以及系统性毒性等诸多挑战。尼克酰胺（Niclosamide, NIC）作为一种已获批准的抗蠕虫药物，近年来其抗癌潜力逐渐被发掘，研究表明它能够通过抑制Wnt/β-catenin、mTORC1、NF-κB、CDK4/6和JAK/STAT3等多个致癌信号通路，在乳腺癌和前列腺癌中发挥抑制细胞增殖、诱导凋亡和限制转移的作用。然而，NIC较差的溶解性、吸收度和代谢不稳定性严重限制了其作为系统性癌症治疗药物的开发应用。

为了改善NIC的药代动力学和药效学特性，研究人员开展了一项创新性研究，通过将NIC的氨基衍生物与多种单环/双环/三环芳香醛或苯乙酮进行缩合反应，合成了13种新型NIC-席夫碱化合物。该研究发表在《Scientific Reports》期刊上，旨在开发具有双重靶向作用的新型抗癌先导化合物。

研究人员采用MTT法评估了这些化合物对前列腺癌细胞（PC-3）和两种乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）的体外抗肿瘤活性。结果表明，化合物8和11表现出最具前景的细胞毒性效果。化合物11对MCF-7、MDA-MB-231和PC-3细胞的IC₅₀值分别为2.85、4.61和7.69μM，而化合物8对MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC₅₀值分别为8.70和8.20μM。

作用机制研究发现，先导化合物8和11对JAK1和CDK7酶具有双重抑制作用。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，它们对JAK1的抑制效果（81-85.5%，53.6-69.18%）优于NIC（75.6%和36.6%）。特别值得注意的是，化合物11在MCF-7（80.7%）和PC-3（83.4%）细胞中对CDK7的抑制活性显著高于NIC。

在细胞周期分析中，化合物11能够将MCF-7细胞阻滞在G₂/M期（35.03%），并显著提高Pre-G₁期细胞比例（20.68%），而对照组分别为20.95%和0.31%。在MDA-MB-231细胞中，化合物11使caspase-1、3和9的水平分别提高至对照组的4.60、3.03和2.69倍，表现出强烈的凋亡诱导能力。流式细胞术结果显示，与对照组MCF-7细胞相比，化合物11将凋亡细胞死亡从1.34%提高至10.92%，坏死细胞死亡从1.05%提高至3.47%。

分子对接研究进一步证实了化合物8和11与JAK1和CDK7活性位点的结合模式，表明它们能够形成稳定、紧密结合的复合物。分子动力学模拟显示，化合物11与JAK1形成的复合物具有优异的稳定性。

本研究采用的关键技术方法包括：经典的有机合成方法（缩合反应）制备目标化合物；多种光谱技术（IR、¹H NMR、¹³C NMR、MS）进行结构确证；MTT法进行体外细胞毒性评价；酶联免疫吸附测定（ELISA）评估JAK1和CDK7抑制活性；流式细胞术进行细胞周期和凋亡分析；计算机辅助药物设计方法（分子对接、分子动力学模拟）研究作用机制。研究所用细胞系（MCF-7、MDA-MB-231、PC-3、WI38）均来自标准细胞库。

化学合成与结构表征

研究人员首先通过锌粉还原法将NIC的硝基还原为氨基，得到NIC-胺中间体2，然后使其与13种不同的芳香醛或苯乙酮发生缩合反应，合成了目标席夫碱化合物3-15。所有新化合物的结构均通过元素分析、红外光谱、核磁共振谱和质谱进行了充分表征。红外光谱中C=N特征吸收峰（1559-1623 cm^-1）的出现以及¹H NMR中甲烯基质子信号（δ 8.56-8.81 ppm）的确认，证明了席夫碱结构的成功形成。

体外细胞毒性评价

初步筛选在50μM浓度下进行，结果显示多数化合物对测试的癌细胞系具有细胞毒性活性。进一步的五点剂量IC₅₀测定表明，化合物7、8、11、14和15表现出优异的抗癌活性和选择性。特别是化合物11，在所有测试的癌细胞系中均显示出个位数微摩尔级别的IC₅₀值，且对正常WI38细胞的毒性较低，表现出良好的选择性指数。

JAK1抑制活性评价

通过ELISA法评估了化合物8和11对JAK1酶的抑制活性。结果显示，这两个化合物在所有测试的癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-231和PC-3）中均表现出比NIC更强的JAK1抑制能力。化合物11在MCF-7细胞中的JAK1抑制IC₅₀值达到0.017μM，显著优于NIC的0.22μM。

CDK7抑制活性评价

对CDK7抑制活性的研究表明，化合物11在MCF-7和PC-3细胞中表现出极强的CDK7抑制活性（抑制率分别为80.7%和83.4%），明显高于NIC（64.3%和66.7%）。这表明化合物11具有双重抑制JAK1和CDK7的独特能力。

细胞凋亡诱导机制

通过检测caspase-1、3和9的活性水平，评估了化合物8和11的凋亡诱导能力。在MDA-MB-231细胞中，化合物11显著上调了所有测试caspase的活性水平，特别是在caspase-1和caspase-9的表达方面，其诱导能力超过了NIC。在PC-3细胞中，化合物8对caspase-3的上调作用与NIC相当。

细胞周期影响分析

流式细胞术分析显示，化合物11处理能显著改变MCF-7细胞的细胞周期分布，使G₂/M期细胞比例增加至35.03%（对照为20.95%），Pre-G₁期细胞比例增加至20.68%（对照为0.31%）。这表明化合物11主要通过诱导G₂/M期阻滞和凋亡来发挥其抗癌作用。

Annexin V-FITC细胞凋亡检测

Annexin V/PI双染实验进一步证实了化合物11的凋亡诱导能力。处理后，MCF-7细胞的总凋亡率从对照组的2.39%增加至14.39%，其中早期凋亡细胞占2.33%，晚期凋亡细胞占8.59%，坏死细胞占3.47%。

计算机辅助药物设计研究

ADME性质预测表明，大多数目标化合物符合Lipinski五规则，具有类药性。分子对接研究显示，化合物8和11能够与JAK1和CDK7的ATP结合口袋形成多种相互作用，包括氢键、疏水作用和π-π堆积作用。分子动力学模拟进一步证实了化合物11与JAK1结合的稳定性。

研究结论与意义

本研究成功设计并合成了一系列新型NIC-席夫碱衍生物，其中化合物8和11表现出优异的抗癌活性和双重JAK1/CDK7抑制能力。特别是化合物11，在多个实验层面均显示出比先导化合物NIC更优的性能：更强的细胞毒性活性、更有效的JAK1和CDK7抑制能力、更显著的凋亡诱导作用以及更稳定的靶点结合特性。

该研究的创新点在于首次报道了具有JAK1和CDK7双重抑制活性的NIC-席夫碱衍生物，为克服NIC的药代动力学局限性提供了有效策略。通过合理的结构修饰，不仅改善了化合物的脂水分配系数，还增强了对关键抗癌靶点的抑制活性。

这些发现为开发新型双靶点抗癌药物提供了重要的先导化合物，尤其对于治疗JAK/STAT信号通路异常激活的癌症类型（如乳腺癌、前列腺癌等）具有重要的理论意义和潜在的应用价值。化合物11作为最具前景的候选化合物，值得进行更深入的临床前研究，以评估其实际的临床应用潜力。