《Scientific Reports》：Efficacy and safety of cryoablation procedures using mouse models of bladder cancer
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本研究针对肌层浸润性膀胱癌(MIBC)根治性膀胱切除术创伤大、患者生活质量(QOL)差的问题，开展了冷冻消融(cryoablation)治疗的主题研究。结果表明，冷冻消融能有效消融肿瘤细胞，术后28天(POD 28)CD4+和CD8+T细胞显著增加，且手术安全可行。这为MIBC的膀胱保留治疗提供了新思路，并为联合免疫治疗奠定了基础。
膀胱癌是全球常见的恶性肿瘤之一，根据肿瘤侵犯的深度，主要分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。对于MIBC患者，目前的标准化治疗方案是根治性膀胱切除术，即切除整个膀胱。然而，这种手术创伤巨大，术后患者需要进行尿流改道，严重影响其生活质量(QOL)。此外，对于高龄或伴有其他并发症的患者，手术风险较高，可能无法耐受。尽管辅助化疗有所改进，MIBC患者的5年生存率仍徘徊在50%-72%之间，疗效并不理想。因此，探索一种既能有效治疗肿瘤，又能保留膀胱功能、提高生活质量的微创治疗方法，成为了泌尿外科领域亟待解决的重要问题。
在这种背景下，冷冻消融技术作为一种局部物理消融疗法，近年来在肝癌、前列腺癌等多种实体肿瘤的治疗中展现出其微创、安全、有效的优势。其原理是利用超低温使肿瘤组织发生凝固性坏死，形成“冰球”。与传统热消融相比，冷冻消融被认为可能保留肿瘤抗原的完整性，从而更有利于激活机体抗肿瘤免疫反应，产生远隔效应(abscopal effect)，这可能对控制MIBC的转移病灶具有潜在价值。然而，冷冻消融技术在膀胱癌，特别是MIBC治疗中的应用尚处于探索阶段，其有效性、安全性以及对局部免疫微环境的影响，亟需在可靠的动物模型中得到验证。
为了回答这些问题，来自日本京都府立医科大学泌尿外科的研究团队Shogo Inui、Saya Ito等人在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们利用化学致癌剂N-丁基-N-(4-羟基丁基)亚硝胺(BBN)诱导建立了小鼠原位膀胱癌模型，模拟人类MIBC，并首次系统性地评估了膀胱外途径冷冻消融术的治疗效果、安全性及其对免疫系统的影响。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，使用化学致癌剂BBN连续喂养C57BL/6小鼠26-28周，成功构建了高成瘤率的原位膀胱癌模型；其次，通过开腹手术暴露膀胱，使用预冷至-196°C的不锈钢探针，对膀胱顶端肿瘤实施两个循环（冷冻30秒/复温30秒）的冷冻消融；第三，采用苏木精-伊红(H&E)染色和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组化染色，系统观察了术后不同时间点（3小时至POD 28）膀胱组织的病理学变化；第四，利用排尿纸迹(VSOP)法无创监测小鼠手术前后的排尿体积和频率，以评估膀胱功能；最后，通过CD4和CD8抗体免疫组织化学染色，定量分析冷冻灶局部T淋巴细胞的浸润情况，以评估免疫激活状态。
研究结果
生理效应与模型建立
研究人员首先成功建立了MIBC小鼠模型。给予BBN后，约86.7%的小鼠在20周左右发展为T2期或更高的MIBC。与未给予BBN的小鼠相比，模型小鼠表现出体重略轻、饮水量增加、总尿量减少但排尿频率增高的特点，这些生理变化与膀胱肿瘤引起的刺激症状相符，表明模型构建成功。
冷冻消融的治疗效果
为了直观验证冷冻消融对癌细胞的杀伤作用，研究团队设计了一个巧妙的实验：将小鼠膀胱一分为二，仅对其中一半进行冷冻处理。术后8小时的组织学检查显示，未经冷冻的半边膀胱边缘仍可见癌细胞，而经过冷冻处理的半边的膀胱肌层则出现了明显的平滑肌细胞核消失、染色变淡以及组织空腔形成，这些均是细胞死亡的特征性表现，直接证明了冷冻消融能有效破坏膀胱癌细胞。
冷冻消融的安全性验证
安全性是评估新疗法的关键。在整个长达28天的观察期内，接受冷冻消融的小鼠均无手术相关死亡。宏观观察发现，膀胱顶端的消融区域在术后7天内可见明显的充血，之后逐渐减轻，到POD 14时基本消失。显微镜下，术后急性期（3小时至POD 3），消融区域的膀胱肌层细胞核显著减少甚至缺失，形成空腔。到POD 7，空腔开始缩小，至POD 14及以后几乎完全被邻近组织替代。通过α-SMA免疫染色进一步观察到，消融区域的平滑肌标志物在POD 7时几乎检测不到，但在POD 14和28时表达逐渐恢复，提示受损组织正在被修复和重塑。此外，与未手术组相比，冷冻消融组小鼠的体重、饮水量、排尿量及排尿频率在术后均未出现持续性的显著差异，表明冷冻消融对小鼠的整体生理状态和膀胱功能影响较小，具有较高的安全性。值得注意的是，术后第7天排尿量短暂减少后，在POD 14出现反弹性增加，研究者认为这可能与组织修复过程中的变化有关。定量分析显示，与术前相比，POD 7、14和28的肿瘤体积均出现了显著缩小。
冷冻消融后的免疫活性
本研究的一个亮点在于探讨了冷冻消融对局部免疫环境的影响。免疫组化结果显示，在患有MIBC的小鼠（BBN处理组）中，与术前（POD-）相比，术后28天（POD 28）冷冻灶局部CD4+和CD8+T细胞的阳性指数均显著升高。而在未患癌的小鼠（BBN未处理组）中，仅CD4+T细胞在POD 28有轻微增加。同时，脾脏中的CD4+T细胞数量在POD 28时两组间无显著差异。这些结果提示，冷冻消融主要诱导了局部而非全身性的免疫反应。这种在损伤组织局部长期存在的T细胞，很可能是组织驻留记忆T细胞(TRM)。TRM细胞能够长期驻留在组织内，执行免疫监视功能，它们的存在可能与持久的抗肿瘤效应相关。
研究结论与意义
本研究通过严谨的小鼠模型实验，首次系统评估了膀胱外途径冷冻消融治疗MIBC的可行性。主要结论可以归纳为三点：第一，冷冻消融能够有效破坏原位膀胱癌模型中的肿瘤细胞，导致肿瘤体积显著缩小；第二，该手术方式在小鼠模型中表现出良好的安全性，无手术相关死亡，对膀胱生理功能影响短暂且可逆，术后组织修复良好；第三，冷冻消融能够激活局部抗肿瘤免疫反应，特别是在长期存活的小鼠中，观察到CD4+和CD8+T细胞在肿瘤局部显著浸润，这为联合免疫治疗提供了理论依据。
这项研究的意义重大。尽管本研究采用的膀胱外途径手术方式并非临床常规，但它为膀胱癌的冷冻消融治疗提供了重要的概念验证(proof-of-concept)。研究结果强有力地支持了“膀胱保留型冷冻疗法”的可行性。这为未来开发经尿道的冷冻消融设备和技术奠定了坚实的实验基础。将这种微创消融技术与现有的膀胱癌免疫疗法，如膀胱内卡介苗(BCG)灌注或免疫检查点抑制剂(ICIs)相结合，有望为不适合或不愿接受根治性膀胱切除术的MIBC患者提供一种全新的、既能有效控制肿瘤又能保留膀胱功能、甚至可能通过激活免疫系统抑制转移的治疗选择。未来，需要更长期的生存数据以及针对TRM细胞等免疫机制的深入探索，以进一步推动这一创新疗法向临床转化。
