《OncoTargets and Therapy》：Tumor-Infiltrating Mast Cells Enhance Neoadjuvant Therapy Efficacy in ESCC via Modulation of the Desmoplastic Microenvironment
编辑推荐：
本文揭示了肿瘤浸润肥大细胞（MCs）通过LPS诱导的非脱颗粒活化模式调控食管鳞癌（ESCC）促纤维化微环境（TME），从而增强新辅助治疗（NAT）敏感性并改善患者预后的新机制。研究整合单细胞测序（scRNA-seq）、临床队列与体外实验，证实高MC密度与较小肿瘤直径（Pearson r = ?0.32）和更长总生存期（36 vs 23.5个月，p=0.038）显著相关，且MC与低间质纤维化组合可进一步优化预后分层。该发现为ESCC靶向治疗提供了新策略。
Abstract
新辅助治疗（NAT）对局部晚期食管鳞状细胞癌（ESCC）至关重要，但其疗效仍需提升。本研究探讨肿瘤浸润肥大细胞（MCs）在治疗反应和预后中的作用。采用整合方法，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、68例初治ESCC手术标本的免疫荧光分析、公共数据集生物信息学分析及体外肥大细胞活化实验。结果显示，单细胞测序揭示治疗后MC在免疫细胞中比例升高（4%至12%），且炎症基因谱富集。在68例患者队列中，较高MC密度与较小肿瘤直径（Pearson r = ?0.32, p=0.007）和显著更好的总生存期（36 vs 23.5个月, p=0.038）相关。巨噬细胞或CD8+T细胞无此相关性。生物信息学分析将MC与细胞外基质（ECM）和血管平滑肌调控相关联。关键的是，高MC密度结合低间质增生或纤维化可识别预后最佳的患者。表型上，MC在原位主要为非脱颗粒状态。体外实验中，LPS激活（非脱颗粒信号）显著上调MC中CCL19等趋化因子。此外，47.1%（32/68）患者肿瘤间质中检测到LPS，而正常黏膜中无。结论表明，肿瘤浸润MC与ESCC新辅助疗效增强和生存改善相关，机制可能涉及LPS诱导的非脱颗粒性MC活化调控促纤维化微环境。靶向该轴为ESCC治疗提供有前景的策略。
Introduction
食管癌是上消化道常见恶性肿瘤，食管鳞状细胞癌（ESCC）是东亚主要组织学类型，全球排名第八位。最新流行病学数据显示，ESCC死亡率居所有癌症第六位，严重威胁人类健康。当前治疗主要依赖手术，化疗、放疗和免疫治疗是重要辅助手段。然而，这些治疗的临床疗效常受耐药性、低敏感性和毒副作用限制。
肿瘤微环境（TME）是实体瘤化疗、放疗和免疫治疗疗效的关键决定因素。TME不仅包括肿瘤细胞，还有癌症相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞、血管网络、细胞外基质（ECM）及多种细胞因子，共同支持肿瘤生存和进展。在增殖和侵袭过程中，癌细胞分泌降解酶和其他活性成分重塑周围ECM。这种相互作用常触发纤维结缔组织过度沉积，即间质增生（desmoplasia），与肿瘤进展、转移和患者预后密切相关。
基质成分积累增加间质压力，降低血流和血管密度，从而阻碍药物递送并导致治疗抵抗。间质纤维化和促纤维化的预后影响因癌症类型而异，在胰腺癌中呈强烈负面，但在乳腺、鼻咽和结直肠癌中仍有争议。ESCC中间质增生与预后的关系较不明确，需进一步研究。
肥大细胞（MCs）是存在于多种组织（包括肿瘤）中的多能免疫细胞。在TME中，MC表现出双重作用，根据上下文促进或抑制肿瘤生长。它们储存和分泌大量生物活性介质，如蛋白酶（如类胰蛋白酶）、组胺、前列腺素、趋化因子和细胞因子。通过这些介质，MC可影响血管生成、免疫细胞招募和成纤维细胞活化。值得注意的是，MC来源的类胰蛋白酶和TGF-β可激活成纤维细胞并促进胶原沉积，从而驱动间质纤维化和结缔组织增生。这种MC介导的促纤维化可能形成物理屏障，阻断抗肿瘤药物和淋巴细胞浸润，潜在促进肿瘤侵袭和转移。因此，靶向MC活化及其促纤维功能是治疗以致密间质为特征的癌症的潜在策略。
我们团队的初步工作和其他报告表明，MC可激活TME中的成纤维细胞并调控其增殖。然而，MC在ESCC促纤维化微环境调控中的具体作用，以及这种调控如何最终影响新辅助治疗疗效，仍知之甚少。我们假设肿瘤浸润MC通过调控促纤维化影响药物递送和免疫浸润，从而影响治疗结果。为此，我们分析了ESCC中MC密度、间质纤维化、促纤维化反应与患者预后的关系。进一步研究这些MC的表型及其对微环境的功能影响，以阐明MC驱动促纤维化调控与新辅助治疗疗效关联的潜在机制。
Metarials and Methods
研究遵循《赫尔辛基宣言》并经河北医科大学第四医院伦理委员会批准。单细胞测序分析获取一例接受新辅助治疗（抗血管生成药联合化疗）的ESCC患者治疗前内镜活检和治疗后手术切除的配对标本。组织病理学和免疫荧光分析采用回顾性队列，包括2021年1月至2023年12月河北医科大学第四医院初治手术切除的68例ESCC患者术后石蜡包埋肿瘤组织。样本量由研究期间符合纳入标准的病例可用性决定。关键纳入标准：组织学确诊ESCC；接受根治性手术且未行术前新辅助治疗；具备完整临床和随访数据。排除标准：诊断时存在远处转移；其他恶性肿瘤史；组织质量不足分析。同时收集配对癌旁正常组织对照。
单细胞RNA测序：新鲜组织标本制备单细胞悬液。每样本加载约10,000细胞捕获~8,000细胞，使用Chromium Single Cell A Chip kit和Single Cell 5’ Library and Gel Bead Kit构建文库。GEMs内条形码逆转录后，cDNA扩增并用Agilent 2100 Bioanalyzer质控。测序文库在Illumina Novaseq6000平台PE150测序，目标深度每细胞至少100,000 reads。原始数据比对hg38人类参考基因组并用CellRanger量化。后续数据分析在R中使用Seurat包进行。低质量细胞过滤标准：UMI计数<8,000、线粒体基因含量>75%或核糖体基因含量<45%。使用DoubletFinder去除潜在双联体。数据标准化、高变基因识别和log归一化使用Seurat函数。为整合不同样本数据并减轻批次效应，应用IntegrateData函数。对整合数据集进行PCA和UMAP降维和可视化。
组织学染色和间质纤维化与促纤维化评估：FFPE ESCC切除标本5μm切片，脱蜡、水化后H&E染色。间质纤维化程度半定量分级为三级：1级（轻度，纤维化区域<肿瘤间质1 3）、2级（中度，1 3至2 3）、3级（重度，>2/3）。促纤维化微环境根据纤维基质性质分为三型：幼稚型（基质存在黏液样变，无论有无瘢痕样胶原）、中间型（存在瘢痕样胶原无黏液样变）、成熟型（两者均无）。所有组织学评估由两名外科医生和一名病理学家独立盲法进行。每例最终分类由至少两名评估者共识确定。
免疫荧光染色：组织免疫荧光中，FFPE切片脱蜡、水化、柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）微波抗原修复后，3%过氧化氢淬灭内源性过氧化物酶15分钟。5% BSA封闭1小时后，切片与一抗（类胰蛋白酶、LPS、CCL19或CXCL8）37°C 1小时或4°C过夜孵育。随后与二抗（生物素化羊抗鼠IgG、链霉亲和素Alexa 488、Rhodamine Red-X驴抗兔IgG或NL637驴抗羊IgG）室温孵育1小时。为减少自发荧光，切片用0.1%苏丹黑B（70%乙醇）处理30分钟。核DAPI复染，封片后Olympus BX53荧光显微镜成像。细胞免疫荧光中，培养HMC-1肥大细胞系用3.7%甲醛固定15分钟，0.2% Triton X-100透化10分钟，5% BSA封闭后与一抗（类胰蛋白酶、CCL19或CXCL8）室温孵育1小时，再与Alexa Fluor 488标记驴抗鼠IgG或Cy3标记驴抗兔IgG孵育1小时。核DAPI染色，Olympus IX73倒置荧光显微镜采集图像。
生物信息学分析：从TCGA数据库下载食管癌（ESCA队列）基因表达数据（FPKM值）和临床信息。基于肥大细胞相关基因KIT和FCER1A中位表达水平将患者分为高、低表达组。使用R中t检验识别组间差异表达基因（DEGs），调整p值（FDR）<0.25为显著。识别KIT和FCER1A比较共享的常见DEGs并用维恩图可视化。使用ClusterProfiler对常见DEGs进行KEGG通路和GO术语功能富集分析，显著性阈值p<0.05。
细胞培养与活化：人肥大细胞系HMC-1在IMDM（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中37°C、5% CO2培养。体外活化时，HMC-1细胞（1×10^6细胞/孔，6孔板）用LPS（0.1或1 μg/mL）处理6小时。PBS载体处理为对照。处理后收集细胞沉淀用于免疫荧光染色，培养上清离心分装-80°C保存。
RNA提取和qRT-PCR：HMC-1细胞用TRIzol提取总RNA。NanoDrop测浓度和纯度。1μg总RNA用TUREscript RT Master Mix逆转录为cDNA。qRT-PCR使用GO Taq qPCR Master Mix在QuantStudio 5系统进行。引物序列：人TPSB2、CXCL8、CCL19、GAPDH。循环条件：95°C 10分钟，95°C 15秒、58°C 30秒、72°C 30秒，40循环。用2-ΔΔCT法计算靶基因相对表达量，GAPDH为内参。
统计分析：使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5进行统计和图形分析。至少三次独立实验数据以均值±SEM表示。两组差异用Student t检验，多组比较用单因素ANOVA及Tukey事后检验。生存分析用Kaplan-Meier法，生存曲线差异用Log rank检验。p<0.05为显著。
Results
有效新辅助治疗后肿瘤浸润肥大细胞比例升高
一例晚期ESCC（III级，III期）代表病例接受抗血管生成药联合TC（紫杉烷和铂类）方案新辅助治疗。4周期后观察到显著肿瘤消退。疗效通过CT扫描和组织病理学H&E染色评估。对该患者新辅助治疗前后新鲜肿瘤标本进行单细胞RNA测序。免疫细胞景观分析显示显著变化：肥大细胞在免疫细胞中比例从治疗前4%升至治疗后12%，尽管绝对数从462降至340。基因表达谱表明治疗后MC增强表达多种细胞因子（如IL1B、IL18、TNF）和趋化因子（如CCL3、CCL4、CCL2、CXCL2、CXCL8）。同时，治疗后成纤维细胞数量增加且多个功能基因过表达。
高密度肿瘤浸润肥大细胞与减少肿瘤负荷和改善生存相关
为表征ESCC中MC分布，分析68例初治患者配对肿瘤和癌旁正常组织。患者基线特征总结。H&E染色用于一般组织学，类胰蛋白酶免疫荧光鉴定MC。MC主要位于癌巢周围肿瘤间质。比较分析显示54例患者肿瘤组织MC密度低于正常黏膜（MC-low），14例较高（MC-high）。观察到肿瘤浸润MC密度与最大肿瘤直径（Pearson r = ?0.32, p=0.007）和病理T分期（Pearson r = ?0.20, p=0.09）显著负相关。与肿瘤分化或淋巴结转移无显著相关。关键的是，MC-high组患者总生存期（36±15.01个月）显著长于MC-low组（23.5±17.07个月；Log rank检验, p=0.038）。
比较评估肿瘤浸润巨噬细胞（CD68+）和CD8+T细胞。两者在肿瘤中密度显著高于正常组织，但其密度与肿瘤直径或总生存期无显著相关。
肥大细胞与促纤维化联合分析优化预后分层
为探索MC功能作用，分析TCGA-ESCC队列数据。MC标志基因KIT和FCER1A在肿瘤组织中表达显著低于正常食管样本。KIT/FCER1A高、低表达组间差异表达基因交叉分析识别87个共享基因。功能富集分析（KEGG和GO）显示这些MC相关基因主要参与“细胞外区域”和“血管平滑肌收缩”。
下一步评估促纤维化微环境。基于H&E染色，促纤维化反应分为成熟（轻度，n=22）或幼稚（重度，n=46）。虽然促纤维化分级单独不能显著分层生存，但在成熟/轻度促纤维化亚组中，高MC密度（MC-high）患者总生存期显著优于低密度（MC-low）（34.5±19.14 vs 27.0±16.56个月；p=0.037）。类似地，间质纤维化分级为轻度（n=28）或重度（n=40）。纤维化分级单独也不影响生存。然而，在轻度纤维化亚组中，MC-high患者再次显示生存优势优于MC-low（36.5±21.99 vs 26.0±12.76个月；p=0.027）。
LPS诱导肥大细胞非脱颗粒活化上调CCL19
研究肿瘤浸润MC活化状态。类胰蛋白酶免疫荧光显示大多数肿瘤和正常组织中MC保留类胰蛋白酶在胞质内，指示非脱颗粒表型。
为模拟体外非脱颗粒活化，用人肥大细胞系HMC-1以LPS刺激。这导致趋化因子基因CCL19、CCL21和CXCL8剂量依赖性上调。免疫荧光确认CCL19和CXCL8蛋白分泌增加。为支持该通路体内相关性，在32/68（47.1%）患者肿瘤间质中检测到LPS，分布模式与MC相似。相反，正常食管黏膜中未检测到LPS。
Discussions
肥大细胞（MCs）在癌症中的作用已超越其过敏经典功能，成为肿瘤微环境（TME）复杂且上下文依赖的调节剂。我们的研究在ESCC中提供临床和机制证据，证明较高密度肿瘤浸润MC与新辅助治疗疗效改善和患者生存更好相关。这种保护性关联似乎与促纤维化微环境调控相关。
我们研究的一个关键新颖发现是单细胞测序揭示有效新辅助治疗后免疫景观中MC相对比例增加。这种变化伴随这些MC中促炎症基因特征富集，提示潜在功能重编程而非被动积累。此外，在我们大队列中，高MC密度与较小肿瘤大小和更优总生存期相关，其他免疫细胞如CD8+T细胞或巨噬细胞无此关系。这强调MC在ESCC进展和治疗反应中独特且关键的作用。
MC在癌症中功能以多效性著称，研究报道根据癌症类型和上下文既有促肿瘤也有抗肿瘤效应。在某些恶性肿瘤中，MC已知促进血管生成和免疫抑制。然而，我们在ESCC的数据与日益增多的证据一致，表明在某些实体瘤中起保护作用。差异可能由其活化状态和后续介质释放谱解释。我们识别ESCC组织中大多数MC处于非脱颗粒状态，细胞内保留类胰蛋白酶等介质。该表型与通过Toll样受体（TLRs）（如TLR4被细菌脂多糖LPS激活）的活化一致，可触发持续细胞因子/趋化因子分泌而无大规模立即脱颗粒。我们的生物信息学分析将ESCC中MC与“血管平滑肌收缩”等过程关联，提示调控血管张力和灌注的潜在作用，可能影响药物递送。
关键的是，我们提出MC与促纤维化间质间的机制联系。体外实验证明LPS激活MC强力上调趋化因子，特别是CCL19。CCL19是淋巴细胞归巢关键趋化因子，并涉及细胞外基质重塑。因此，我们假设在ESCC TME中，被瘤内细菌（如我们近半数肿瘤中检测到LPS所提示）招募和潜在激活的MC可能分泌一系列因子，帮助维持较少纤维化、更有序的间质结构。这得到我们临床观察支持：高MC密度的生存优势在低级别促纤维化和纤维化患者中最显著。较不致密、更成熟的间质可能促进灌注增强和化疗药物渗透改善，从而解释与更好新辅助治疗疗效的关联。该模型协调我们的发现，将MC定位为基质组成的调节剂，其活性可间接增强治疗反应。
我们研究的几个局限性应承认。首先，队列分析回顾性性质和单中心设计需前瞻性多中心研究验证。其次，虽然体外数据支持LPS激活MC的功能作用，但MC衍生因子直接调控ESCC TME中成纤维细胞活性和胶原沉积的精确分子机制需进一步研究，理想通过体内模型。最后，瘤内LPS的具体来源和ESCC中MC激活信号的完整谱有待充分阐明。
尽管有这些局限性，我们的发现照亮有前景的治疗途径。未来研究应探索MC的药理学调控——例如，通过促进其“有利”非脱颗粒表型或利用其趋化因子分泌——是否可用于正常化促纤维化间质。这种策略可作为辅助手段增强ESCC患者常规新辅助治疗的疗效。
Conclusions
总之，我们的整合分析表明肿瘤浸润肥大细胞与ESCC新辅助治疗疗效增强和生存改善相关。我们提出该效应至少部分通过促纤维化微环境调控介导。肥大细胞，可能被细菌产物如LPS以非脱颗粒方式激活，可能贡献于更允许药物递送和抗肿瘤活性的间质表型。因此，靶向肥大细胞和基质组分间的串扰代表改善ESCC治疗结果和患者预后的潜在新策略。
Ethics Approval
研究遵循《赫尔辛基宣言》（2013修订）并经河北医科大学第四医院伦理委员会批准（批准号：2017016）。获得所有患者知情同意。
Author Contributions
所有作者对报告工作做出重大贡献，无论是在概念、研究设计、执行、数据获取、分析和解释，或所有这些领域；参与起草、修订或批判性审阅文章；最终批准发布版本；同意文章提交期刊；并对工作所有方面负责。
Disclosure
作者声明无利益冲突。
