《Horticulture Research》：PnWRKY38-PnSUS1 axis regulates the biosynthesis of Panax notoginseng saponins
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本研究为解决三七皂苷(PNS)生物合成中糖基化步骤的供体UDP-葡萄糖(UDPG)供给瓶颈问题，揭示了转录因子PnWRKY38通过直接激活蔗糖合成酶基因PnSUS1的表达，显著提升UDPG库容和三七皂苷产量的分子机制，为药用植物代谢工程提供了新靶点。
在传统中药宝库中，三七（Panax notoginseng）以其卓越的活血化瘀功效而闻名，其核心药效成分是一类被称为三七皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)的三萜皂苷。然而，三七的产业化之路布满荆棘：漫长的生长周期、苛刻的环境要求，特别是连作障碍导致的活性成分含量下降，严重制约了高质量三七药材的稳定供应。因此，解析三七皂苷生物合成的分子调控网络，通过现代生物技术手段提高其产量，成为学界和产业界共同关注的焦点。
三七皂苷的合成是一条复杂而耗能的代谢通路。其骨架来源于类异戊二烯途径，但真正赋予其丰富结构和药理活性的关键步骤是糖基化修饰。在这一过程中，尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose, UDPG)作为关键的活化糖供体，由UDP-糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases, UGTs)催化，将葡萄糖基连接到皂苷元（如原人参二醇PPD和原人参三醇PPT）上。可以说，细胞内的UDPG库容量直接决定了皂苷合成的效率。那么，是什么在控制着这个关键“货币”的供应呢？蔗糖合成酶(Sucrose synthase, SUS)被认为是连接初级碳代谢（蔗糖）与次级代谢（UDPG）的桥梁，但三七中哪个SUS基因扮演了核心角色？其表达又受何种上游信号调控？这些问题的答案，犹如一把钥匙，有望打开提升三七皂苷产量的“总阀门”。
针对上述问题，研究人员展开了一项系统性的研究。该研究首先从三七基因组中成功鉴定出7个蔗糖合成酶基因(SUS)，并发现其中PnSUS1和PnSUS2在皂苷主要富集部位——根中表达最高。随后的体外酶活实验证实，只有PnSUS1能够高效催化UDP生成UDPG，而PnSUS2则无此活性，这表明PnSUS1是三七中负责为皂苷糖基化提供UDPG的关键酶。功能验证实验表明，在三七细胞中过表达PnSUS1可显著提升UDPG含量和多种单体皂苷（如人参皂苷Rd、Rb1、Rg1、Re及三七皂苷R1）的积累；反之，抑制PnSUS1表达则导致皂苷产量大幅下降。这直接证明了PnSUS1是三七皂苷合成通路中的代谢瓶颈。
研究的另一大亮点是发掘了PnSUS1的上游调控因子。通过对PnSUS1启动子序列的分析，研究人员预测其含有WRKY转录因子的结合位点（W-box）。利用酵母单杂交(Yeast one-hybrid, Y1H)技术从文库中筛选，他们发现了一个名为PnWRKY38的WRKY转录因子能够直接结合PnSUS1的启动子。PnWRKY38同样在根中高表达，且其表达可被茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate, MeJA)诱导。亚细胞定位显示PnWRKY38定位于细胞核，符合其转录因子功能。进一步的实验证明，PnWRKY38能够特异性结合PnSUS1启动子上的W-box1和W-box2 motif，并强力激活其转录。在三七细胞中过表达PnWRKY38，不仅能上调PnSUS1的表达，还能提高SUS酶活性和UDPG水平，最终使总皂苷含量提升2.1-2.4倍。
最令人振奋的是，当研究人员将PnWRKY38与PnSUS1在三七细胞中共同过表达时，观察到了显著的协同效应。与单独过表达PnSUS1相比，共表达细胞系的UDPG和总皂苷含量得到了进一步的提升。这一结果提示，通过操控关键转录因子来系统性地“解锁”整个代谢通量，可能比单纯增强单个酶的表达更为高效。
本研究首次描绘了一条从转录因子到最终产物的完整调控链条：PnWRKY38 → PnSUS1基因 → PnSUS1酶 → UDPG → 皂苷。这不仅深化了我们对三七皂苷合成复杂调控网络的理解，也为通过代谢工程策略培育高皂苷含量的三七新品种提供了坚实的理论依据和有效的分子工具。该研究成果发表于《Horticulture Research》期刊。
为开展本研究，作者主要应用了以下关键技术：从三七基因组中挖掘SUS基因家族并进行系统进化分析；通过原核表达重组PnSUS蛋白并进行体外酶动力学测定；利用农杆菌介导的遗传转化技术在三七细胞中实现基因过表达和RNA干扰(RNAi)；通过酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶报告基因(Dual-luciferase, LUC)实验验证蛋白质与DNA的直接相互作用；利用激光共聚焦显微镜观察转录因子的亚细胞定位；采用高效液相色谱(HPLC)和液质联用(LC-MS)技术定量分析UDPG和皂苷含量。
Identification and characterization of SUS genes from the P. notoginseng genome
研究人员从三七基因组中鉴定出7个推测的蔗糖合成酶(SUS)基因，它们分布在7条不同的染色体上。系统进化分析显示这7个蛋白分为三个亚家族。表达模式分析发现，PnSUS1和PnSUS2在根中的表达水平最高，与皂苷积累和UDPG含量的组织分布模式一致，提示它们可能参与三七皂苷的生物合成。
In vitro enzyme assays of recombinant PnSUS protein
体外酶活测定结果显示，重组PnSUS1蛋白能够催化反应生成UDPG，而PnSUS2则无此活性。分子对接分析表明PnSUS1与底物UDP具有较高的结合亲和力。酶动力学分析显示PnSUS1具有较高的催化效率。
PnSUS1 positively regulated biosynthesis of saponins in P. notoginseng
功能研究证实PnSUS1正向调控三七皂苷的生物合成。在三七细胞中过表达PnSUS1能显著提高UDPG含量、总皂苷以及多种单体皂苷（如人参皂苷Rd、Rb1、Rg1、Re和三七皂苷R1）的水平。相反，利用RNAi技术抑制PnSUS1表达则导致UDPG和皂苷含量显著降低。这些结果直接证明了PnSUS1通过供应UDPG在三七皂苷合成中发挥关键作用。
Screening of potential transcription factors activating PnSUS1 transcription
为了寻找调控PnSUS1的上游因子，研究人员克隆了其启动子区域，并发现其中含有3个W-box顺式作用元件。通过酵母单杂交文库筛选，鉴定出一个WRKY转录因子PnWRKY38能够激活PnSUS1的启动子。PnWRKY38在根中表达最高，且其表达受MeJA诱导。亚细胞定位证实PnWRKY38是一个定位于细胞核的蛋白。
PnWRKY38 directly bind to the PnSUS1 promoter
分子互作实验证实了PnWRKY38对PnSUS1的直接调控。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验均表明，PnWRKY38能够特异性结合PnSUS1启动子上的W-box1和W-box2 motif，并显著激活其转录活性。
Effects of co-overexpressing PnWRKY38 and PnSUS1 in P. notoginseng
协同过表达实验揭示了PnWRKY38和PnSUS1的协同增效作用。与单独过表达PnSUS1相比，共表达PnWRKY38和PnSUS1能进一步显著提升三七细胞和叶片中的UDPG含量和皂苷产量，表明通过调控上游转录因子来优化整个代谢通路是一种更高效的策略。
本研究首次阐明了一个完整的转录调控模块：WRKY转录因子PnWRKY38通过直接激活蔗糖合成酶基因PnSUS1的表达，增加UDPG的供给，从而促进三七皂苷的生物合成。这一发现不仅揭示了皂苷糖基化上游供体调控的新机制，也为通过代谢工程策略系统性地提高三七及其他药用植物中皂苷类活性成分的产量提供了新的分子靶点和理论框架。未来的研究可以进一步探索调控PnWRKY38表达的上游信号通路，以及将其应用于三七全株遗传改良的潜力。
