《Biotechnology Reports》：Production and characterization of rNGFSP: a recombinant fusion immunogen eliciting dual anti-NGF and anti-Substance P therapeutic antibodies for Degenerative Joint Disease
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本研究针对退行性关节疾病中NGF和SP介导的神经源性炎症与慢性疼痛，开发了一种新型重组融合蛋白rNGFSP。通过在大肠杆菌中表达并纯化，rNGFSP作为免疫原可在小鼠、兔、马和大中诱导产生同时靶向天然NGF和SP的交叉反应性IgG抗体。功能实验证实这些抗体能有效抑制NGF与TrkA受体结合及SP诱导的肥大细胞脱颗粒。该疫苗策略为同时阻断NGF-SP轴提供了成本低、作用持久的治疗新方案，具有重要转化价值。
退行性关节疾病（Degenerative Joint Disease, DJD）如骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是困扰人类和伴侣动物的常见疾病，其特征为关节软骨退化、炎症和持续性疼痛。目前，尽管抗神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）单克隆抗体（如Bendivetmab和Frunevetmab）已在犬猫OA疼痛治疗中获批，但其广泛应用受限于高昂成本和需反复注射的弊端。更重要的是，OA慢性疼痛的机制复杂，NGF与其下游信号分子P物质（Substance P, SP）在“神经源性炎症”环路中协同作用，共同维持疼痛与炎症状态。然而，尚无靶向SP的成熟免疫疗法。因此，开发一种能同时中和NGF和SP的创新治疗策略，对于打破这一恶性循环、提供更经济有效的治疗方案具有迫切需求。在此背景下，研究人员在《Biotechnology Reports》上发表了其最新研究成果。
为开展本研究，研究人员主要运用了以下关键技术：重组蛋白在原核表达系统（大肠杆菌BL21(DE3)）中的表达与通过包涵体金属螯合层析（IMAC）的纯化工艺；质谱（MS）用于确认蛋白分子量与氨基酸序列完整性；AlphaFold21结合分子动力学（MD）模拟预测rNGFSP的空间结构；使用小鼠、兔、马、犬等多种动物模型进行疫苗免疫原性与安全性评价；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原特异性及交叉反应抗体；并利用基于TF1细胞增殖、PC12细胞分化以及原代骨髓来源肥大细胞（BMMCs）脱granulation的细胞功能实验评估抗体中和活性。
3.1. 重组抗原rNGFSP的表达与纯化
研究人员成功在大肠杆菌中表达了包含N端多组氨酸标签、犬NGF核心域和C端SP序列的重组融合蛋白rNGFSP。该蛋白以包涵体形式存在，经变性条件溶解、IMAC纯化及内毒素去除后，获得纯度达80-90%的目的蛋白，产量约为120 mg/L培养液。SDS-PAGE显示其表观分子量约为17.5 kDa，与理论值一致。
3.2. rNGFSP抗原的质谱分析
质谱分析确认rNGFSP主要为单体形式，分子量与预期相符。检测到因尿素处理导致的轻微氨甲酰化修饰，但Top Down MS/MS分析证实了其氨基酸序列的正确性，覆盖度超过75%，表明蛋白结构完整。
3.3. 计算机模拟与分子动力学揭示rNGFSP中NGF域的结构稳定性
AlphaFold2预测显示rNGFSP的NGF核心域结构稳定，而SP尾部及linker区域柔性较高。分子动力学模拟进一步证实NGF域（残基37-138）在1 μs模拟时间内构象稳定，RMSF分析提示柔性区域主要位于loop区，支持其作为良好免疫原的潜力。
3.4. rNGFSP在细胞实验中缺乏NGF和SP生物活性
功能实验证实，rNGFSP本身不能诱导PC12细胞神经突生长、TF1细胞增殖或肥大细胞脱颗粒，表明其作为免疫原不具NGF或SP的固有生物活性，确保了疫苗接种的安全性。
3.5. rNGFSP在小鼠中的安全性与耐受性
小鼠接种含佐剂的rNGFSP后，未出现全身性不良反应，血液学及生化指标均在正常范围内，证明其具有良好的安全profile。
3.6. rNGFSP在兔、马和大中的免疫原性
在兔、马和大中接种rNGFSP疫苗后，均能诱导产生高水平的抗rNGFSP特异性IgG抗体，且抗体滴度随加强免疫而显著升高。仅在大中观察到轻微、短暂的局部注射部位反应。
3.7. rNGFSP诱导针对天然NGF和SP的交叉反应抗体
重要的是，疫苗接种后产生的抗体能够识别天然构象的二聚体NGF和酰胺化SP，表明rNGFSP所含表位能有效模拟内源性靶标。
3.8. rNGFSP免疫大所获抗体中和NGF和SP活性
功能验证显示，免疫后大血清或纯化IgG能显著抑制NGF与TrkA受体的结合，并有效阻断SP诱导的肥大细胞脱颗粒，证实了所诱导抗体的治疗潜力。
本研究成功设计并表征了新型重组融合免疫原rNGFSP。该蛋白可在多种动物体内诱导产生能同时中和NGF和SP功能的双特异性抗体。rNGFSP本身无生物活性，安全性良好。这一主动免疫策略为同时靶向NGF-SP轴、治疗退行性关节疾病相关的慢性疼痛和神经源性炎症提供了一种全新的、可能更具成本效益的替代方案，突破了现有单抗疗法的局限，在兽医及潜在的人类医学领域具有重要的转化前景。
