《Brain, Behavior, and Immunity》：Tumor–Macrophage–Nerve interactions drive neuroinflammation and neuropathic pain in prostate cancer perineural invasion
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本研究针对前列腺癌神经侵袭（PNI）引发的难治性疼痛机制不明的问题，通过建立大鼠坐骨神经神经内膜内注射AT-1前列腺癌细胞的PNI模型，系统探究了肿瘤-巨噬细胞-神经相互作用。研究发现PNI诱导了以M1型为主的巨噬细胞浸润及促炎因子（IL-1β, TNF-α）上调，伴随促肿瘤因子（RANTES, IL-1ra, TIMP-1, VEGF）升高和神经元损伤标志物（ATF-3, NGF, GDNF）表达增加。背根神经节（DRG）神经元中cAMP-pCREB-ERK1/2信号通路持续激活，行为学上表现为进行性机械/冷痛觉超敏和热痛觉过敏，且鞘内抑制ERK1/2磷酸化可逆转机械痛觉超敏。该模型为解析PNI相关神经病理性疼痛的神经炎症机制及靶向治疗提供了重要平台。
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，其进展过程中一个显著的特征是倾向于沿着神经束侵袭生长，这一现象被称为神经侵袭（Perineural Invasion, PNI）。在临床实践中，高达80%的前列腺癌病例存在PNI，并且这与严重的、通常对常规镇痛药抵抗的疼痛密切相关。这种疼痛极大地降低了患者的生活质量，但其背后的具体分子和细胞机制尚不十分清楚。传统的癌症疼痛模型，如将肿瘤细胞注射到骨骼或皮下组织，虽然提供了有价值的见解，但未能完全模拟癌细胞直接侵入神经鞘内微环境所触发的独特病理生理过程。因此，开发能够精确再现PNI的临床前模型，对于揭示肿瘤、免疫细胞和神经之间复杂的相互作用如何驱动神经炎症和疼痛至关重要。
为了深入探究前列腺癌PNI引发的神经病理性疼痛机制，由Shaaban A. Mousa和Michael Sch?fer等领导的研究团队在《Brain, Behavior, and Immunity》上发表了一项研究。他们建立了一种新型的大鼠模型，通过将表达绿色荧光蛋白（GFP）的AT-1前列腺癌细胞直接显微注射到近交系哥本哈根大鼠的坐骨神经神经内膜内，模拟了人类前列腺癌的PNI过程。该模型使得肿瘤生长局限于注射部位，避免了全身性转移带来的混杂效应，从而能够专注于研究由直接肿瘤-神经相互作用所驱动的局部和区域性变化。
研究人员在为期21天的观察期内，综合运用了行为学评估、分子生物学技术和组织病理学分析。他们系统地表征了肿瘤的进展、免疫细胞的浸润、关键信号通路的激活以及疼痛行为的发展。
本研究应用了几项关键的技术方法。首先是建立了大鼠坐骨神经神经内膜内前列腺癌细胞注射的PNI模型。其次，通过蛋白质芯片阵列（Proteome Profiler Array）和酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析了神经组织中的细胞因子和生长因子水平。第三，利用定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测了多种mRNA的表达变化，包括细胞增殖标志物、趋化因子、巨噬细胞标志物、细胞因子和神经元损伤/再生相关因子。第四，采用免疫组织化学和免疫荧光染色及共聚焦显微镜技术，在组织水平上观察了肿瘤浸润、巨噬细胞募集以及背根神经节（DRG）神经元内信号分子（如cAMP, p-CREB, p-ERK1/2）的定位和表达。最后，通过von Frey纤维丝测机械痛阈、Hargreaves测热痛阈以及丙酮蒸发试验测冷痛觉，系统评估了啮齿类动物的痛觉敏感性变化。
3.1. 一般观察和神经周围肿瘤进展
AT-1细胞注射后，坐骨神经部位形成了可触及的肿块样肿瘤，神经重量显著增加，并伴随进行性的后肢运动功能损伤和自发性疼痛行为评分升高。
3.2. AT-1细胞神经膜侵袭的显微镜分析
组织学分析显示，AT-1细胞从注射后第3天起主要位于神经束膜，随后逐渐侵入神经束膜和神经内膜。免疫荧光证实了GFP标记的肿瘤细胞在神经内的渐进性浸润，并与神经纤维密切接触。
3.3. 肿瘤微环境相关关键因子的早期和持续上调
蛋白质组学分析发现，在肿瘤浸润的坐骨神经中，促肿瘤因子如RANTES（CCL5）、IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）、血管内皮生长因子（VEGF）和组织金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）从第3天起即显著上调，并持续至第21天。
3.4. 神经周围肿瘤侵袭过程中的巨噬细胞浸润和细胞因子谱
肿瘤进展伴随着显著的巨噬细胞浸润。qRT-PCR显示巨噬细胞标志物CD68以及趋化因子CCL2的mRNA表达持续增加。进一步对巨噬细胞极化的分析表明，促炎（M1型）巨噬细胞标志物CD80和CD86的表达持续上调，而抗炎（M2型）标志物CD163和CD206的表达仅早期短暂升高。与此一致，M1型相关促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平在整个21天观察期内均显著升高。
3.5. 神经元损伤和神经炎症标志物的持续上调
研究发现，神经元损伤标志物ATF-3以及神经营养因子NGF和GDNF的mRNA表达在肿瘤侵袭的坐骨神经中呈现时间依赖性的上调，表明存在持续的神经应激和重塑过程。
3.6. 肿瘤进展过程中背根神经节（DRG）内损伤介导的神经元超兴奋性
免疫荧光分析显示，在DRG神经元中，胞浆内cAMP和核内磷酸化CREB（p-CREB）的免疫反应性从第3天起显著增加并维持在高水平。同时，神经元标志物NeuN阳性的DRG神经元中磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表达也持续上调，表明MAPK信号通路在PNI相关的痛觉敏化中被激活。
3.7. AT-1细胞神经周围接种诱导进行性机械和冷痛觉超敏
行为学测试表明，AT-1细胞注射诱导了进行性的机械性痛觉超敏、热痛觉过敏和冷痛觉超敏。这些痛觉行为变化与肿瘤浸润程度相关。重要的是，连续鞘内给予MEK/ERK通路抑制剂PD98059，能够显著逆转AT-1细胞诱导的机械性痛觉超敏。
该研究的讨论部分总结并强调了其发现的重要意义。研究表明，直接在前列腺癌PNI模型中，肿瘤细胞在神经内的生长伴随着显著的、以M1型为主的巨噬细胞浸润和持续的神经炎症反应。这种肿瘤-免疫-神经的相互作用导致了促肿瘤微环境的形成和神经元损伤标志物的上调。在感觉神经元水平，cAMP-pCREB和ERK1/2信号通路的持续激活是神经元超兴奋性的关键分子基础，并与神经病理性疼痛行为的发展密切相关。ERK信号通路抑制剂的镇痛效果进一步证实了该通路在PNI相关疼痛中的重要作用。
综上所述，这项研究成功建立并验证了一个能够模拟前列腺癌PNI及其相关疼痛的临床前模型。该模型揭示了肿瘤-巨噬细胞-神经三方互作在驱动神经炎症和神经元敏化中的核心作用，并指出ERK信号通路是一个潜在的治疗靶点。尽管该模型主要聚焦于局部神经事件，未能完全模拟临床晚期癌症患者复杂的疼痛状况（如神经丛受累），但它为逐步研究肿瘤诱导的神经元反应提供了一个有价值的平台，有助于未来开发针对癌症PNI相关神经病理性疼痛的更有效疗法。
