LncR12304.1-miR1507c-CsNADH-GOGAT ceRNA模块调控茶树氨基酸生物合成的分子机制

《Horticulture Research》：LncR12304.1-miR1507c-CsNADH-GOGAT ceRNA module regulates amino acid biosynthesis in tea plant (Camellia sinensis)

本研究针对茶树氨基酸代谢调控机制不清的问题，通过系统分析发现miR1507c可直接靶向CsNADH-GOGAT基因。进一步筛选出lncR12304.1作为ceRNA竞争性结合miR1507c，在茶树和烟草中验证了该ceRNA模块对谷氨酸和茶氨酸合成的调控作用，为高氨基酸茶树品种选育提供了新靶点。

　　

茶作为世界三大饮料之一，其独特风味主要来源于茶叶中的氨基酸类物质，尤其是茶氨酸（L-theanine）占茶叶干重的1%-2%，是形成茶汤鲜爽味的主要成分。然而，茶树中氨基酸代谢的调控机制，特别是在转录后水平的调控网络仍不明确。竞争性内源RNA（ceRNA）调控机制在动物和模式植物中已被广泛研究，但在茶树等木本植物中的功能验证仍较为缺乏。与此同时，谷氨酸合成酶（GOGAT）作为氮同化关键酶，其长达6kb的cDNA序列使得功能研究困难，关于非编码RNA对其调控的报道更是少见。因此，解析ceRNA网络调控茶树氨基酸代谢的分子机制，对于阐明茶树品质形成机理和育种实践均具有重要意义。

本研究主要采用了长链非编码RNA测序（lncRNA sequencing）、双荧光素酶报告基因检测（DLR assay）、5'RNA连接酶介导的快速扩增cDNA末端（5'RLM-RACE）、荧光原位杂交（FISH）、RNA pull-down结合实时荧光定量PCR（qPCR）以及瞬时转基因技术。研究以茶树'舒茶早'品种为材料，设置不同浓度尿素处理，采集根和茎尖样品进行后续分析。

MiR1507c靶向调控CsNADH-GOGAT的验证

通过双荧光素酶报告基因实验发现，共表达miR1507c和CsNADH-GOGAT的烟草叶片中Luc/Ren比值显著低于单独表达CsNADH-GOGAT的组别。5'RLM-RACE进一步证实miR1507c在CsNADH-GOGAT开放阅读框区的第11-12位碱基处存在切割位点。在烟草叶片中过表达CsNADH-GOGAT可获得最高荧光强度，而共表达miR1507c和CsNADH-GOGAT则荧光最弱。同时，miR1507c的过表达显著抑制了内源烟草NtNADH-GOGAT同源基因的表达。

与miR1507c相互作用的lncRNA筛选与鉴定

对不同氮处理下的茶树样品进行lncRNA测序，共鉴定到53，206个lncRNA。氮供应使茶树根部lncRNA数量减少而茎尖增加。通过靶向关系筛选初步获得62个可能与miR1507c结合的lncRNA，从中选择结合能<-23.5 kcal/mol且最小自由能（MFE）比率>70%的四个候选分子进行验证。lncR12304.1因其高丰度和显著的氮响应性被选为重点研究对象。

LncR12304.1与miR1507c的靶向互作关系

TargetScan预测显示miR1507c在lncR12304.1第469-488位核苷酸处存在结合位点。荧光原位杂交证实miR1507c（红色荧光）与lncR12304.1（绿色荧光）在细胞质中共定位。RNA pull-down实验表明，lncR12304.1可被miR1507c探针显著富集，富集倍数达3.34×10³和2.32×10³倍，而CsNADH-GOGAT富集倍数为4.07×10³倍，证实了miR1507c与两者间的特异性物理结合。双荧光素酶报告基因实验进一步验证了lncR12304.1与miR1507c的直接靶向关系。

LncR12304.1作为ceRNA在体内调控CsNADH-GOGAT

在不同氮水平处理的茶树中，随着氮浓度增加，miR1507c表达量呈剂量依赖性下降，而lncR12304.1水平呈相反趋势。氮肥显著上调了大部分谷氨酸和茶氨酸生物合成关键基因（CsFd-GOGAT、CsTS、CsGS1、CsGS2、CsGDH），除根部CsNADH-GOGAT、CsFd-GOGAT和CsGS1在3%氮处理下被抑制外。相应地，L-谷氨酸含量随氮有效性增加而逐步上升，茶氨酸积累在茎尖于1%氮时达到峰值，而在根部需要3%氮才能最大生产。

利用Antagomir瞬时抑制茶树中miR1507c表达10小时后，lncR12304.1和CsNADH-GOGAT转录水平在茎尖和根部均显著上调。统计分析显示miR1507c与lncR12304.1/CsNADH-GOGAT表达呈负相关，而lncR12304.1与CsNADH-GOGAT呈正相关。同时，谷氨酸和茶氨酸含量显著增加。

在瞬时转基因烟草中，当lncR12304.1与miR1507c和CsNADH-GOGAT共同过表达时，miR1507c丰度显著低于仅共表达miR1507c和CsNADH-GOGAT的烟草。相反，CsNADH-GOGAT表达在lncR12304.1存在下显著升高。CsNADH-GOGAT过表达显著增强了L-谷氨酸积累，其变化模式与CsNADH-GOGAT表达模式一致。L-谷氨酰胺积累也受转化影响，其变化模式与L-谷氨酸几乎相反。作为茶氨酸合成另一底物乙胺的来源，L-丙氨酸在转基因株系中显著减少。

本研究首次在茶树中实验验证了一个完整的ceRNA调控模块——lncR12304.1-miR1507c-CsNADH-GOGAT，该模块通过lncR12304.1竞争性吸附miR1507c，减轻miR1507c对CsNADH-GOGAT的抑制，从而正向调控谷氨酸和茶氨酸的生物合成。这一发现不仅完善了茶树氮代谢的"RNA层调控"理论，为高氨基酸茶树品种的定向育种提供了科学依据，而且将miR1507c的功能从已知的逆境响应扩展到了氨基酸代谢领域。研究建立的实验体系也为其他木本植物ceRNA网络的功能验证提供了参考。需要注意的是，未来研究需直接测定CsNADH-GOGAT酶活性和蛋白丰度，以更全面阐明该ceRNA模块对氨基酸代谢通量的调控机制。