《The Crop Journal》：Layered nitrogen application increases post-anthesis nutrient accumulation and grain yield of wheat by coordinating root morphology and nutrient transporter gene expression
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本研究针对水稻盐胁迫耐受性调控机制不明的关键问题，揭示了OsMAP4K6通过直接磷酸化OsMKK6第13位丝氨酸（Ser13）激活其激酶活性，从而增强根系Na+外排、维持Na+/K+稳态的新通路。该发现首次在植物中建立了MAP4K与MAPK级联途径的直接联系，为作物抗逆育种提供了重要靶点。
随着全球气候变化加剧，土壤盐渍化已成为制约农业生产的世界性难题。据统计，全球约三分之一的可耕地受到盐胁迫影响，导致作物减产高达50%-70%。水稻作为全球过半人口的主粮，对盐分尤为敏感，因此解析其耐盐机制对保障粮食安全具有重大战略意义。尽管植物MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联通路在逆境应答中的核心作用已被广泛认知，但位于该通路最上游的MAP4K（MAPK激酶激酶激酶）家族成员的功能，特别是在单子叶植物中的调控机制，仍存在大量空白。
为填补这一知识缺口，南京农业大学的研究团队在《The Crop Journal》发表了最新成果，首次报道了水稻OsMAP4K6正向调控盐胁迫耐受性的新功能，并创新性地揭示了其通过直接磷酸化OsMKK6第13位丝氨酸（Ser13）从而激活MAPK信号通路的分子机制。这项研究不仅鉴定了一个关键的耐盐正调控因子，更开辟了植物MAP4K家族功能研究的新视角。
研究人员综合运用了基因编辑（CRISPR-Cas9）技术构建OsMAP4K6和OsMKK6的敲除和过表达株系、蛋白互作验证（GST pull-down、Co-IP、LCI）、体外磷酸化 assay、质谱（LC-MS/MS）鉴定磷酸化位点、非损伤微测技术（NMT）检测离子流以及生理指标测定等关键技术方法。所有实验材料均使用日本晴（Nipponbare）水稻背景。
3.1. OsMAP4K6是水稻中一个功能保守的激酶
系统进化分析将OsMAP4K6归类于Clade III-B亚家族，与拟南芥AtMAP4K4（TOT3）亲缘最近。该蛋白具有典型的激酶结构域特征，包括Glycine-rich环、用于ATP结合的K43位点、HRD激活基序和DFG激活片段。体外激酶实验证实OsMAP4K6具有自磷酸化活性，其点突变体OsMAP4K6K43A则丧失活性。亚细胞定位显示OsMAP4K6定位于细胞质和细胞膜。表达模式分析表明OsMAP4K6在根和叶中均有较高表达，且其转录本和激酶活性均可被盐胁迫诱导。
3.2. OsMAP4K6正向调控水稻的盐胁迫耐受性
表型分析发现，在正常条件下，OsMAP4K6过表达（OE）、敲除（KO）和野生型（WT）植株无显著差异。但在120 mmol L-1NaCl处理7天并恢复8天后，OE株系存活率和叶绿素含量显著高于WT，而KO株系则相反。盐胁迫下，OE株系的丙二醛（MDA）含量和电解质渗漏率增幅最小，KO株系最大。DAB和NBT染色进一步显示KO株系积累了更多的活性氧（ROS）。此外，OE株系在盐胁迫下的根和地上部生长受抑制程度也更轻。
3.3. OsMAP4K6通过增强Na+外排和促进K+吸收来增强耐盐性
离子含量测定显示，盐胁迫后，OE株系地上部和根部的Na+含量较低，K+含量较高，因而Na+/K+比也低于WT和KO株系。NMT动态监测发现，盐胁迫下OE株系根系具有更强的Na+外排能力和K+吸收趋势（或更弱的K+外排），而KO株系则表现为较弱的Na+外排和较强的K+外排。
3.4. OsMAP4K6与OsMKK6发生物理互作
通过IP-MS筛选、GST pull-down、Co-IP和LCI等多种技术，证实OsMAP4K6与OsMKK6在体外和体内均能直接相互作用，且盐胁迫能增强这种互作。结构域映射实验表明，OsMAP4K6的N端与OsMKK6的N端负责互作。
3.5. OsMAP4K6可磷酸化OsMKK6的Ser13并调控其活性
体外激酶实验结合LC-MS/MS分析确定OsMKK6的Ser13是OsMAP4K6的直接磷酸化位点。通过构建OsMKK6的非磷酸化（S13A）和磷酸化模拟（S13D）突变体，发现S13D突变体在体外和体内（水稻原生质体）均表现出更强的激酶活性。更重要的是，盐胁迫下，OsMKK6的激活依赖于OsMAP4K6，因为OsMAP4K6的缺失会显著削弱盐胁迫诱导的OsMKK6活性升高。
3.6. OsMKK6表现出与OsMAP4K6相似的盐胁迫应答
遗传证据表明，OsMKK6过表达株系增强耐盐性，而敲除株系则更敏感，其表型与OsMAP4K6转基因株系一致。同样，OsMKK6也通过调控根系Na+外排和K+稳态来行使功能。
本研究首次将水稻OsMAP4K6确立为盐胁迫耐受性的正调控因子。其创新性在于发现了一条全新的信号传导模块：盐胁迫激活OsMAP4K6，活化的OsMAP4K6直接与OsMKK6互作并磷酸化其Ser13位点，此磷酸化事件对于OsMKK6在盐胁迫下的充分激活至关重要。激活的OsMKK6进而通过其下游信号通路，最终调控离子转运蛋白（如可能通过OsMPK6影响OsSOS1等）的活性，促进Na+外排、抑制K+流失，从而维持细胞离子稳态并增强耐盐性。这一发现突破了植物MAP4K家族功能认知的局限，首次在分子水平上将MAP4K与MAPK级联通路直接联系起来，为理解植物复杂逆境信号网络提供了新的框架。尽管OsMKK6的上游调控存在复杂性（如可能存在OsMAPKKK63等负调控因子），但OsMAP4K6-OsMKK6模块的阐明无疑为作物抗逆遗传改良提供了有价值的候选基因和理论依据，对应对全球盐渍化挑战、保障粮食安全具有深远意义。
