《The Crop Journal》：Maize EMP14 is required for mitochondrial RNA editing and intron splicing
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本研究揭示了玉米E型PPR蛋白EMP14通过调控线粒体nad4基因的RNA编辑（ccmFC-966、nad4-819和nad4-i3-2687位点）和内含子剪接（nad4内含子3），影响线粒体复合物I的组装与活性，最终调控胚胎和胚乳发育的分子机制。该研究为理解植物线粒体RNA加工与种子发育的关联提供了新见解。
在高等植物中，线粒体作为半自主性细胞器，其基因表达需要通过RNA剪接、编辑、成熟和稳定化等转录后加工过程才能产生有功能的蛋白。这些过程由核基因编码的多种因子调控，其中pentatricopeptide repeat（PPR，五肽重复）蛋白家族在细胞器RNA代谢中发挥核心作用。尽管已知PPR蛋白参与线粒体RNA加工，但许多PLS亚家族PPR蛋白在玉米线粒体RNA编辑和内含子剪接中的具体功能仍不清楚。
玉米种子发育是作物产量的基础，任何影响胚胎和胚乳发育的缺陷都会导致严重减产。empty pericarp（空稃）表型是玉米种子发育异常的典型特征，但其分子机制尚未完全阐明。本研究聚焦于一个导致空稃表型的突变体emp14，旨在解析其分子功能及在种子发育中的作用。
为探究EMP14的功能，研究人员首先通过图位克隆技术将Emp14基因定位到玉米第7染色体上一个约6Mb的区间，并鉴定出Zm00001d019525基因的突变是导致emp14表型的原因。该基因编码一个E亚类PPR蛋白，定位于线粒体。通过创制多个等位突变体（emp14-ref、emp14-1和emp14-2）并进行遗传互补实验，证实了该基因与表型的因果关系。
研究采用的主要技术方法包括：突变体的细胞学观察和遗传分析、图位克隆与基因鉴定、亚细胞定位、RT-PCR和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析线粒体基因表达、RNA编辑效率检测、蓝绿原生胶电泳（BN-PAGE）和复合物活性分析、蛋白质免疫印迹、酵母双杂交和荧光互补成像分析蛋白质相互作用，以及体外剪接实验。所有实验材料均来自玉米田间种植群体和EMS诱变群体。
3.1. emp14突变体的表型特征
研究发现emp14-ref突变体表现为典型的空稃表型，胚胎和胚乳发育严重受阻。通过石蜡切片观察发现，突变体胚胎发育停滞在过渡阶段，而野生型胚胎已进入晚期胚胎发生阶段。胚乳发育同样延迟，导致种子最终形成空稃表型。
3.2. Emp14的图位克隆
通过传统图位克隆策略，研究人员将Emp14定位到染色体7上约6Mb的物理区间内。该区间内仅有一个PPR基因（Zm00001d019525），测序发现emp14-ref突变体在该基因的+831bp处有一个单碱基T插入，导致阅读框移位。两个独立等位突变体（emp14-1和emp14-2）的遗传分析进一步证实了该基因与表型的关联。
3.3. Emp14编码线粒体定位的E亚组PPR蛋白
Emp14编码一个含有8个PPR基序和E1/E2结构域的典型E亚类PPR蛋白。亚细胞定位实验显示EMP14-GFP融合蛋白与线粒体标记信号共定位，证实其线粒体定位。表达分析表明Emp14在玉米组织中组成型表达。
3.4. Emp14缺陷影响nad4内含子3的剪接
转录组分析发现，emp14突变体中成熟nad4转录本显著减少，而大多数其他线粒体转录本水平无变化。进一步分析显示，nad4内含子3的剪接效率显著降低，而其他内含子的剪接不受影响，表明EMP14特异性参与nad4内含子3的剪接调控。
3.5. EMP14参与nad4内含子3的C2687位点编辑
序列分析发现，emp14突变体中nad4内含子3的C2687位点（nad4-i3-2687）编辑完全缺失。该位点位于nad4内含子3二级结构的Domain VI（D6）区域，编辑缺失导致D6区域二级结构改变，可能影响内含子的正确剪接。
3.6. EMP14参与ccmFC-966和nad4-819位点的编辑
RNA编辑效率分析显示，emp14突变体中ccmFC-966位点的编辑完全缺失，nad4-819位点编辑效率降低，表明EMP14参与多个线粒体RNA编辑位点的调控。
3.7. EMP14缺失影响线粒体复合物I组装
BN-PAGE和复合物活性分析表明，emp14突变体中复合物I的组装和NADH脱氢酶活性显著降低，而复合物III和V积累增加。免疫印迹分析显示复合物I亚基Nad9蛋白水平降低，证实复合物I组装受损。
3.8. emp14中替代呼吸途径增强
AOX蛋白水平在emp14突变体中升高，特别是AOX2转录本表达上调，表明线粒体替代呼吸途径被激活，可能是对复合物I功能缺陷的补偿反应。
3.9. EMP14与脱氨酶PCW1相互作用
酵母双杂交和荧光互补实验显示，EMP14与trans脱氨酶PCW1相互作用，但不与bCCP1直接相互作用。EMP14与已知的nad4内含子3剪接因子（SPR2、PPR-SMR1、EMP602、DEK41）无直接相互作用，表明其可能通过独立机制影响剪接。
本研究首次揭示了玉米E型PPR蛋白EMP14通过调控线粒体RNA编辑和内含子剪接，影响线粒体复合物I组装和种子发育的分子机制。研究发现EMP14特异性参与nad4基因的转录后加工：一方面负责ccmFC-966、nad4-819和nad4-i3-2687位点的C-to-U编辑；另一方面影响nad4内含子3的正确剪接。这些功能的缺失导致nad4成熟转录本减少，线粒体复合物I组装受损，最终引发胚胎和胚乳发育异常。
值得注意的是，nad4-i3-2687位点的编辑缺失与内含子剪接缺陷同时发生，且该位点位于剪接位点附近，提示RNA编辑可能通过改变内含子二级结构影响剪接效率。虽然体外剪接实验未能证实编辑状态对剪接的直接影响，但体内数据强烈支持二者之间的功能关联。
EMP14与trans脱氨酶PCW1的相互作用为其在RNA编辑中的功能提供了机制解释，而其影响内含子剪接的具体机制仍需进一步研究。该研究不仅拓展了对PPR蛋白功能多样性的认识，也为理解线粒体RNA加工与植物发育的关联提供了重要线索，对作物遗传改良具有潜在应用价值。研究成果发表于《The Crop Journal》，为植物线粒体生物学领域做出了重要贡献。
