双胱氨酸稳定的互补决定区3在病毒中和抗体高亲和力优化中的潜力研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：High-affinity optimization potential of the virus neutralizing antibody with twin cysteine-stabilized complementarity-determining region 3

本研究揭示了重链互补决定区3（H3 CDR）构象稳定性，特别是通过双胱氨酸基序（twin cysteine motif）的稳定化，对人工智能（AI）驱动的中和单克隆抗体（NMAbs）亲和力成熟潜力的关键影响。通过对比具有固定化与柔性H3 CDR环的SARS-CoV-2 NMAbs，研究证实H3 CDR稳定化能显著提升AI优化效果，获得亲和力更高、中和效力更强的抗体变体，为针对快速进化病毒病原体的高效治疗性抗体开发提供了新策略。

　　

引言

在COVID-19大流行期间，中和单克隆抗体（NMAbs）等治疗剂的使用在对抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染中发挥了重要作用。然而，病毒的高频突变导致的免疫逃逸对NMAbs的有效性构成了挑战。因此，及时进行抗体亲和力优化以应对SARS-CoV-2变异至关重要。传统实验筛选方法耗时且难以跟上病毒变异速度，而人工智能（AI）方法，特别是机器学习（ML）模型，在抗体优化领域正日益突出。抗体开发的主要挑战在于重链（H）互补决定区3（CDR3）环的序列设计和结构预测。H3环通过体内体细胞重组机制自然成熟，其巨大的序列多样性（理论数量可达约10¹⁸）对AI辅助的NMAbs设计和优化提出了挑战。因此，基于抗体优化潜力（即抗体在优化后获得增量特性如亲和力的序列和结构基础潜力）的种子抗体选择是病毒NMAbs AI优化的首要任务。本研究旨在探讨H3 CDR稳定化对病毒中和抗体亲和力优化潜力的影响，比较了具有或不具有胱氨酸稳定化H3 CDR的两组SARS-CoV-2 NMAbs在AI优化后的体外和体内病毒中和活性及抗体-抗原（Ab-Ag）相互作用。

材料与方法

抗体优化基于种子抗体

研究选取了五种靶向SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）的商业化且序列可用的单克隆抗体（AZD8895、Sotrovimab、REGN10933、REGN10987和MW05）作为种子抗体。使用先前开发的语言模型引导的抗体生成对抗网络（AbGAN-LMG）和BERT2Dab语言模型对这些抗体进行优化。基于“亲和力为主，其他特性和专家判断为辅”的综合评价标准，为每个种子抗体选择了5个候选抗体，共30个抗体用于后续蛋白质表达和实验验证。

NMAbs的构建、表达与纯化

将构建的30个抗体的重链和轻链质粒转化至JM108克隆菌株。使用质粒提取试剂盒提取转染级质粒，然后通过Lipofectamine 3000将质粒转染至HEK293哺乳动物细胞中进行瞬时表达。使用HiTrap Protein A HP纯化所得蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot（WB）检测单克隆抗体（mAbs）的表达水平和纯化效果。

生物层干涉技术与表面等离子共振

使用Gator?无标记生物分析系统进行生物层干涉技术（BLI）分析，评估抗体与SARS-CoV-2刺突RBD蛋白的结合亲和力。同时，使用BiacoreS200仪器通过表面等离子共振（SPR）检测抗体与SARS-CoV-2 RBD的亲和力。动力学值使用1:1结合模型计算。

酶联免疫吸附测定

使用酶联免疫吸附测定（ELISA）评估NMAbs与灭活SARS-CoV-2病毒（野生型，Wuhan-Hu-1）的结合。计算半数最大有效浓度（EC₅₀）。

假病毒中和试验

评估抗体样品对SARS-CoV-2假病毒（基于野生型Wuhan-Hu-1）的中和活性。将系列稀释的抗体样品与等体积稀释的假病毒溶液混合，孵育后加入Vero细胞，通过检测相对光单位（RLU）值计算假病毒感染抑制率。

针对SARS-CoV-2病毒的体外中和试验

进行活SARS-CoV-2中和试验。将SARS-CoV-2（Omicron BA.5）与不同浓度的NMAbs孵育后，再与Vero细胞孵育，观察细胞病变效应（CPE），并报告50%中和剂量（ND₅₀）。

NMAbs和SARS-CoV-2受体的结构预测及NMAb与SARS-CoV-2受体的结构对接

使用AlphaFold2预测NMAbs和SARS-CoV-2受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的三维（3D）结构。使用LightDock进行蛋白质-蛋白质对接，以探索NMAb与ACE2之间可能的相互作用。使用pyrosetta的ddG包计算野生型AZD8895和模拟突变型（C101A和C106A，破坏C101/C106二硫键）的自由能。

抗体的治疗效果评估

在雌性K18-hACE2转基因小鼠中评估抗体的治疗效果。小鼠经鼻感染SARS-CoV-2后，腹腔注射抗体AZD8895–275或AZD8895（10 mg/kg剂量）。记录体重变化，并在感染后第3天收集肺组织用于通过实时RT-PCR评估病毒载量。

统计分析

使用GraphPad Prism 9.0进行所有统计分析。对符合正态分布的两组数据比较采用非配对Student t检验。多组分析采用单因素方差分析（ANOVA）。

结果

评估SARS-CoV-2 NMAbs亲和力优化潜力的流程

研究首先使用已建立的AbGAN-LMG AI模型优化了两类种子NMAbs：一类具有H3 CDR环内二硫键固定化特征（以抗体AZD8895为例），另一类包含相对柔性的H3 CDR环（具体为Sotrovimab、REGN10933、REGN10987和MW05）。基于这五种种子NMAbs，生成了五组优化抗体的序列。每组经过评分和筛选后，选择前五个序列。随后，这五组NMAbs（一种种子抗体及其对应的优化抗体）进行表达和纯化过程。其功能属性通过一系列湿实验进行验证。此外，通过分子对接分析进一步审视了优化过程中H3 CDR灵活性对亲和力增强的影响。

具有稳定化H3 CDR的种子SARS-CoV-2 NMAb的高优化潜力

SDS-PAGE和WB结果显示，具有固定H3 CDR的种子抗体AZD8895及其优化变体（AZD8895-25, AZD8895-275, AZD8895-449, AZD8895-450）成功表达。BLI评估五组抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合亲和力发现，除了基于AZD8895的优化抗体显示出结合能力外，源自非稳定化种子抗体（Sotrovimab、REGN10933、REGN10987和MW05）的优化抗体在BLI检测中未显示可检测的与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。优化抗体与种子抗体的解离常数（K_D）比值显示，AZD8895的优化抗体具有与种子抗体相当或更优的K_D值（平均K_D比值为0.88），而基于其他四种种子NMAbs的优化抗体则无法检测到K_D值。假病毒中和试验初步验证了抗体的功能，结果显示，源自AZD8895的系列抗体表现出强大的假病毒中和能力，而源自其他四种种子抗体的系列抗体则未显示出理想的中和效果。这些结果共同证明，双胱氨酸稳定的H3 CDR是AI驱动亲和力优化成功的关键决定因素。

优化后H3 CDR稳定的SARS-CoV-2 NMAb的亲和力和中和能力提升

鉴于AZD8895及其优化抗体的强劲表现，进一步验证了它们的生物学功能。SPR测量这些抗体与SARS-CoV-2刺突蛋白的结合亲和力，结果显示种子抗体AZD8895的K_D值为12.6 nM，而AZD8895–25和AZD8895–275的K_D值分别为4.79 nM和8.42 nM，表明亲和力显著提高。抗体AZD8895–449和AZD8895–450未显示明显的亲和力增强。ELISA评估NMAbs与灭活SARS-CoV-2的结合显示，三种修饰抗体——AZD8895-25、AZD8895-275和AZD8895-449——与种子抗体AZD8895类似，表现出强烈的剂量依赖性反应活性。修饰抗体的结合亲和力显著增强：AZD8895的EC₅₀为0.083 μg/mL，而AZD8895-25、AZD8895-275和AZD8895–449的EC₅₀值分别为0.008、0.019和0.025 μg/mL。抗体AZD8895–450在测试条件下未显示显著结合。这些NMAbs对SARS-CoV-2假病毒在Vero细胞中的中和活性评估显示，抗体AZD8895-449（IC₅₀= 4.8 ng/mL）的中和能力与种子抗体AZD8895（IC₅₀= 5.3 ng/mL）相当。抗体AZD8895–25和AZD8895–275表现出显著增强的中和效果，IC₅₀值分别为3.2 ng/mL和3.0 ng/mL。活病毒中和能力评估进一步揭示，抗体AZD8895–449的中和效果与种子mAb无显著差异，而抗体AZD8895–25和AZD8895–275则显示出比AZD8895更强的中和效果，AZD8895–450不能中和活病毒。假病毒（IC₅₀）和活病毒（ND₅₀）中和效力之间的强相关性（R2 = 0.9108）验证了假病毒试验作为真实病毒中和预测工具的可靠性。

优化后H3 CDR稳定的SARS-CoV-2 NMAb结合力的3D结构增量

为了探索优化后的NMAb与SARS-CoV-2受体ACE2之间可能的相互作用变化，使用AlphaFold2预测了两种蛋白质的3D结构，并使用LightDock进行了对接。由于H3 CDR稳定的SARS-CoV-2 NMAb AZD8895的序列比对，四个优化后的NMAbs仅在双胱氨酸内部或附近发生了三到四个残基的突变。这种少数位点的残基替换仅导致优化后NMAbs与种子AZD8895相比产生轻微的结构偏差（均方根偏差RMSD为1.0787 ± 0.6885）。另一方面，在相同的生成模型下，基于H3 CDR非稳定化种子抗体（Sotrovimab）的优化NMAbs倾向于产生多达六到七个突变残基，并且结构变化更大（与其种子NMAb相比，RMSD为3.3413 ± 3.4368）。此外，优化后NMAb亲和力和中和能力的提升并不依赖于NMAb的结构波动，这也暗示了双胱氨酸对NMAb优化潜力的独立贡献。ACE2与NMAb AZD8895之间放大的界面显示了两个可能的相互作用残基对：AZD8895中的105SER与ACE2中的477SER，以及AZD8895中的108ASP与ACE2中的486PHE。特别是，AZD8895–25中的105CYS与ACE2中的477SER之间的相互作用比AZD8895–450中的105ILE与ACE2中的477SER之间的相互作用更紧密。这种相互作用差异与生物学验证的两种NMAbs的结合和中和活性相匹配。这些结果表明，AZD8895–25更强的结合和中和活性得益于其在结构上与ACE2更紧密的结合。与AZD8895的模拟突变体CDR H4（C101A和C106A）相比，双胱氨酸的稳定作用也通过固定的DCR H3得以体现。CDR3中每个突变的双胱氨酸CDR H3环组的较低自由能也支持了这种作用。

优化后H3 CDR稳定的SARS-CoV-2 NMAb的体内病毒中和能力提升

体内中和潜力是评估抗病毒候选药物有效性的关键指标之一。之前的实验已证明，在优化后的NMAbs中，抗体AZD8895–25表现出最强的病毒中和能力。我们进一步在动物感染模型中评估了抗体AZD8895–275的治疗效果。小鼠首先感染SARS-CoV-2，然后在感染后第1天静脉注射单剂量10 mg/kg的AZD8895–275或AZD8895。模拟组小鼠接受等体积的PBS。在感染后第3天评估体重变化和病毒载量。结果显示，模拟组小鼠体重下降了9.28%，而用AZD8895–275或AZD8895治疗的小鼠体重保持稳定，两组抗体治疗组之间的体重变化无显著差异。这表明在感染小鼠的体重维持方面，AZD8895–275并未比AZD8895带来显著优势。尽管两种抗体在预防体重减轻方面效果相当，但AZD8895-275治疗组小鼠肺组织病毒载量显著降低，证明其在抑制病毒复制方面具有更优的功效。

讨论

AI和计算技术极大地促进了生物序列、生物分子结构及其他特性的预测和生成任务的进展。通过克服传统经验性抗体开发策略的一些局限性，一些抗体开发和优化流程也取得了一些有希望的结果。特别是，针对SARS-CoV-2和HIV的人类中和抗体的深度学习引导优化已有零星报道。然而，抗体序列巨大的多样性空间（约10¹⁵种全长抗体变体）对AI优化中种子抗体的选择和靶向提出了挑战。在本研究中，我们比较了具有或不具有双胱氨酸稳定的H3 CDR3的两种类型种子抗体对抗SARS-CoV-2病毒的中和抗体的优化潜力。我们的结果确认了具有双胱氨酸稳定的H3 CDR的种子SARS-CoV-2 NMAb具有高优化潜力。这种潜力体现在来自具有双胱氨酸稳定的H3 CDR的SARS-CoV-2 NMAb的优化后NMAbs的抗体-抗原相互作用增强、亲和力增加以及中和能力提升。值得一提的是，优化后的SARS-CoV-2 NMAbs亲和力的增加在体外和体内水平均得到了证实。此外，AZD8895–25和AZD8895–450的对比结果强调，虽然稳定的H3 CDR支架为优化提供了一个有利的平台，赋予了对突变的耐受性，但功能上的成功仍然关键取决于引入替换的性质。这凸显了AI驱动的方法虽然强大，但并不能绕过通过实验验证来筛选生成变体的必要性。

双胱氨酸介导的环状基序稳定化对于HIV表面蛋白可变区的结构和功能至关重要，这与中和逃逸和广度发展相关。同样，它在细胞表面钙敏感受体和植物螯合肽合成酶（PCSs）中也发挥作用。另一方面，域间双胱氨酸介导的稳定化也有助于单链抗体片段（scFv）的抗体亲和力。因此，我们推测这种双胱氨酸介导的蛋白质基序固定化不仅可以防止该基序中可能发生的突变导致剧烈的结构变化，还可以减少其对其邻近基序结构变异的潜在影响。这一假设被我们的结果所证实，结果显示，基于双胱氨酸稳定化种子NMAb的五个优化后MNAbs的3D结构变化最小，而基于无双胱氨酸稳定化种子NMAbs的其他优化后MNAbs结构变化更大。

基于AI的方法在抗体开发方面已取得有希望的成就。种子抗体优化策略和从头设计策略都聚焦于抗体的CDR，主要是H3 CDR。因此，种子H3 CDR3的选择对于基于AI的抗体开发是首要且至关重要的。我们的结果暗示了H3 CDR优化潜力的高度重要性：发现结构稳定的H3 CDR相对于不稳定的H3 CDR具有显著优势，且这与双胱氨酸介导的H3 CDR稳定化相关。因此，包括病毒NMAbs在内的双胱氨酸稳定化抗体，作为亲和力优化的种子抗体显示出巨大潜力，并且是抗体从头设计的有希望的候选者。此外，我们的结果强调了需要从人类抗体库中筛选更多胱氨酸稳定化抗体用于中和病毒，从而制定策略：首先筛选具有稳定化H3 CDR的种子NMAbs，其次通过AI方法优化抗体亲和力。需要指出的是，本研究仅针对一种病毒靶标（SARS-CoV-2野生型Wuhan-Hu-1）进行亲和力优化，并且仅测试了一种变异株（Omicron BA.5）对优化后NMAbs的中和效果。未来的工作对于优化针对一系列当前和新兴SARS-CoV-2变异株的NMAbs，并评估这些优化抗体的中和广度以判断其潜在治疗效用至关重要。还应注意到，当前研究设计中没有包括未感染对照组。虽然治疗组与感染模拟组相比体重的稳定强烈表明了治疗效果，但在未来研究中纳入初始对照组将为更精确量化治疗的健康益处提供有价值的基线。此外，模拟的种子突变体AZD8895（带有C101A和C106A替换）表明CDR3的稳定化程度显著降低，自由能更高，且基于突变种子的CDR3优化抗体的自由能变异更大。当然，对双胱氨酸稳定作用的更多实验验证将强化关于CDR3中双胱氨酸稳定贡献的结论。双胱氨酸对H3 CDR的稳定贡献需要在其他抗体中进一步评估。

结论

总之，本研究发现了双胱氨酸稳定的H3 CDR对于病毒NMAbs亲和力优化的重要意义。一个具有双胱氨酸稳定的H3 CDR的SARS-CoV-2 NMAb在其对SARS-CoV-2的体外和体内亲和力方面被成功优化。我们的结果凸显了胱氨酸稳定的H3 CDR在NMAb优化中的高度重要性。