慢性胰腺炎通过菌群-肠-脑轴失调介导小鼠焦虑抑郁样行为

《Frontiers in Immunology》：Dysregulation of the microbiota-gut-brain axis induced by chronic pancreatitis mediates anxiety- and depression-like behaviors in mice

本文揭示了慢性胰腺炎（CP）通过诱导肠道菌群失调，进而激活下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、促进神经炎症及扰乱脑内神经递质传递，最终导致焦虑和抑郁样行为的全新机制。研究通过粪菌移植（FMT）和混合益生菌（MP）干预，证实了靶向调控菌群-肠-脑（MGB）轴对改善CP相关心理共病的潜在治疗价值，为临床干预提供了重要实验依据。

　　

1 引言

慢性胰腺炎（CP）是一种进行性炎症和纤维化疾病，常伴有严重并发症，包括持续性疼痛、外分泌和内分泌功能障碍，以及焦虑和抑郁等神经精神表现。作为CP患者中普遍存在的共病，焦虑和抑郁不仅加剧了临床负担，而且与疾病加速进展和较差的治疗结局相关。尽管其临床影响重大，但CP与焦虑、抑郁相关联的确切机制仍不清楚。

肠道菌群受到多种宿主和环境因素的动态调控。新出现的证据证实，胰腺外分泌功能障碍显著影响肠道微生态。一致地，在CP患者和实验性CP模型中均观察到了肠道菌群失调。肠道菌群失调不仅加剧肠屏障功能障碍，还通过菌群-肠-脑（MGB）轴调节中枢神经系统（CNS）活动。菌群失调可影响免疫反应，促进脂多糖（LPS）和细胞因子进入血液，进而影响血脑屏障（BBB）的完整性，激活HPA轴并引发CNS炎症。此外，菌群衍生代谢物，如短链脂肪酸（SCFAs）、色氨酸和神经递质前体γ-氨基丁酸（GABA），作为神经内分泌信号和情绪调节的关键介质，在MGB轴的串扰中发挥调节功能。

虽然CP个体中肠道菌群的改变和焦虑/抑郁症状已被独立报道，但胰腺炎症、微生物生态学和神经精神表现之间的复杂关系需要系统研究。因此，本研究建立了实验性CP小鼠模型，以评估MGB轴的改变及其对焦虑和抑郁样行为的功能影响。

2 材料与方法

2.1 实验性CP小鼠模型的建立与益生菌给药

使用八周龄雄性C57BL/6小鼠，通过连续5周腹腔注射雨蛙素（Cae；100 μg/kg）建立实验性CP模型。正常对照（NC）小鼠同时注射等体积生理盐水。在另一组实验中，CP小鼠每日灌胃含有四种乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus）的混合益生菌（MP）悬液（1×10⁹CFU/只）。所有动物实验程序均经上海交通大学附属第一人民医院动物护理和使用委员会批准。

2.2 抗生素介导的肠道菌群耗竭与粪菌移植

使用抗生素混合物（ABX；含氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑和万古霉素）灌胃2周以耗竭小鼠肠道菌群。随后，将接受ABX处理的小鼠分别移植NC小鼠或CP小鼠的粪菌悬液（ABX+FN组和ABX+FC组），持续2周，建立FMT模型。

2.3 行为学测试

按顺序进行旷场实验（OFT）、高架十字迷宫实验（EPMT）、悬尾实验（TST）、强迫游泳实验（FST）和蔗糖偏好实验（SPT），以评估焦虑和抑郁样行为。

2.4 组织学与分子生物学分析

采用苏木精-伊红（H&E）和Masson染色评估胰腺和结肠病理变化。通过免疫荧光和蛋白质印迹（Western Blot）检测紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的表达。使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清LPS和皮质酮水平。通过16S rRNA测序分析肠道菌群组成，通过非靶向代谢组学分析血清代谢物，并通过转录组测序分析大脑皮层基因表达。

3 结果

3.1 CP诱导小鼠产生焦虑和抑郁样行为

与NC小鼠相比，Cae诱导的CP小鼠体重和胰腺重量显著降低。H&E和Masson染色显示CP小鼠出现广泛的胰腺腺泡萎缩、纤维结缔组织增生和炎症细胞浸润，α-SMA阳性区域显著扩大，证实了CP典型病理特征。行为学测试表明，CP小鼠在OFT中中央区域停留时间和进入次数减少，在EPMT中开放臂停留时间和进入次数减少，在FST和TST中不动时间延长，在SPT中蔗糖偏好降低，表明CP小鼠表现出显著的焦虑和抑郁样行为。

3.2 CP诱导小鼠肠道菌群失调并导致乳杆菌减少

16S rRNA测序显示，CP小鼠肠道菌群的β多样性降低，群落结构发生显著改变。在门水平上，CP小鼠Bacteroidota和Campylobacterota丰度增加，Firmicutes/Bacteroidota比值降低。在属水平上，益生菌属Lactobacillus（特别是Lactobacillus murinus和Lactobacillus intestinalis）丰度显著下调，而机会性病原体Helicobacter（如Helicobacter typhlonius和Helicobacter hepaticus）丰度增加。LEfSe分析表明Lactobacillus是驱动两组微生物群落差异的关键生物标志物。相关性分析显示多个差异菌属与行为学测试结果相关。功能预测表明CP小鼠的优势菌群在神经活性配体-受体相互作用、细胞凋亡、内吞和糖胺聚糖降解等通路中显著富集。

3.3 CP诱导的肠道菌群失调促进小鼠焦虑和抑郁样行为的发生

ABX和FMT实验证实，移植CP小鼠粪菌的ABX+FC小鼠，即使其胰腺未出现病理改变，也表现出与CP小鼠一致的焦虑和抑郁样行为：OFT和EPMT中探索行为减少，FST和TST中不动时间延长，SPT中蔗糖偏好降低。这表明CP诱导的肠道菌群失调是驱动焦虑和抑郁样行为的独立因素。

3.4 CP诱导的肠道菌群失调导致肠屏障功能受损

CP小鼠和ABX+FC小鼠均出现结肠绒毛萎缩、血清LPS水平升高、结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1表达下调，以及炎症因子IL-6和TNF-α mRNA表达上调。这表明CP诱导的菌群失调是驱动肠屏障损伤和炎症反应的核心因素。

3.5 CP诱导的肠道菌群失调导致小鼠HPA轴激活

血清非靶向代谢组学分析显示，CP小鼠血清代谢谱发生显著改变，共鉴定出448种差异代谢物。皮质酮及其代谢物（皮质醇、可的松、四氢可的松和20β-二氢皮质醇）水平在CP小鼠中显著升高，且固醇激素生物合成通路富集。多种差异细菌与这些代谢物相关，其中Lactobacillus与这些代谢物显示出显著相关性。ELISA检测进一步证实CP小鼠和ABX+FC小鼠血清皮质酮水平均显著升高，表明CP诱导的菌群失调触发了HPA轴的异常激活。

3.6 CP诱导的肠道菌群失调诱发神经炎症和神经递质紊乱

大脑皮层转录组测序显示，CP小鼠共有168个基因表达发生显著改变。GO和KEGG富集分析表明，这些基因参与应激反应、行为、免疫反应、对共生体和LPS的反应，并广泛参与神经活性配体-受体相互作用。具体表现为GABA能（Gabra1, Gabra4, Gabrg3等）、谷氨酸能（Grm1, Grm3, Grm4, Grm7）、胆碱能、多巴胺能和血清素能神经传递相关受体基因表达下调。同时，CP小鼠和ABX+FC小鼠均出现BBB功能受损（脑内Claudin-1和ZO-1表达下调）、脑组织炎症因子IL-6和TNF-α mRNA表达上调，以及IBA1⁺小胶质细胞激活（分支减少、胞体增大）。表明CP诱导的菌群失调通过多种途径影响CNS，包括诱导神经递质紊乱和促进神经炎症。

3.7 益生菌治疗可恢复CP引起的行为失调

MP治疗虽未改善CP小鼠的胰腺纤维化，但显著逆转了CP诱导的焦虑和抑郁样行为：OFT和EPMT中探索行为增加，FST和TST中不动时间缩短，SPT中蔗糖偏好提高。同时，MP治疗改善了CP引起的肠屏障和BBB功能损伤，降低了结肠和脑组织的炎症水平，并减轻了小胶质细胞的激活。表明补充MP能有效逆转CP诱导的小鼠行为异常。

4 讨论

本研究证实CP诱导的肠道菌群失调通过调节MGB轴促进小鼠焦虑和抑郁样行为的发生。CP引起肠道菌群组成改变，其特征是益生菌Lactobacillus减少和机会病原体Helicobacter增加。这种菌群失调损害肠屏障功能，导致血清LPS升高，进而激活HPA轴，促进全身性和中枢神经炎症，并扰乱脑内神经递质（如GABA、谷氨酸、5-HT、多巴胺）系统的平衡，最终引发行为异常。FMT实验证明CP来源的菌群可独立诱导行为异常。MP干预则通过补充有益菌群，修复肠屏障和BBB功能，减轻炎症，部分逆转神经递质受体表达异常，从而改善CP相关的心理共病。

本研究首次系统阐明了CP通过MGB轴介导焦虑抑郁行为的机制，强调了肠道菌群在CP心理共病中的核心作用。研究结果不仅为理解CP与神经精神症状的关联提供了新的机制见解，也为临床应用益生菌等菌群靶向干预措施治疗CP相关心理共病提供了潜在的实验依据和治疗策略。靶向调控MGB轴可能成为改善CP患者生活质量和预后的新方向。