《Frontiers in Microbiology》：Rice-eel system combined with exogenous organic waste improves soil quality under nitrogen deficiency by regulating soil microbial community
编辑推荐：
本研究通过长期田间试验，揭示了稻鳝共作系统结合秸秆还田和有机肥替代化肥对土壤质量的多维度改善作用。结果表明，该系统显著提升土壤有机质（SOM）、有效磷（AP）等养分含量，增强土壤大团聚体（R0.25）稳定性，并重塑微生物群落结构，富集Chloroflexi、Acidobacteriota等功能菌群，强化好氧呼吸（细胞色素c途径）等代谢通路。研究为生态农业提供了减少化肥依赖、提升土壤健康的新策略。
1 引言
稻渔综合种养是中国南方水稻产区的重要农业模式，基于生态共生和功能互补原理，优化浅水稻田环境中的空间和资源利用。将鱼类、蟹类或小龙虾等水生动物整合到水稻种植中，已被广泛证明可增强土壤生物活性和经济回报，主要通过改善养分有效性、减少害虫压力和更高效的田间管理，从而提高水稻产量和盈利能力。先前对稻鱼、稻虾和稻小龙虾系统的研究一致证明了这些农艺和经济效益。然而，大多数现有研究基于短期实验，主要关注产量相关性状和表层土壤养分响应。这种方法不足以捕捉种养结合系统下土壤结构发育、养分稳定和微生物群落演替的累积和时间依赖性过程。特别是土壤团聚体形成、有机碳固存、磷转化和微生物网络重组通常发生在多年时间尺度上，无法通过短期观察可靠评估。除了经济效益，这种综合系统通过减少化肥投入、增强田间水体净化和减轻面源污染，为环境可持续性做出贡献。诸如稻河蟹和稻小龙虾等系统可将甲烷排放减少高达22%，凸显了它们在减缓气候变化中的潜在作用。此外，这些系统通过将生物扰动与养分循环相结合，有助于防止土地退化并维持农业生态系统的稳定性。相应的长期田间证据表明，稻渔系统增强了土壤大团聚体形成，增加了土壤有机碳（SOC）储量，并提高了磷的有效性，从而有助于持续的土壤质量改善。因此，在稻田推广生态种养模式对于农业的可持续发展至关重要。
土壤微生物是土壤质量和健康的关键指标，在土壤肥力和养分循环中发挥重要作用。稻渔系统已被证明可以改变土壤微生物群落的结构。Si等人（2017）报道稻虾系统增强了土壤微生物活性和多样性。类似地，Wu等人（2024）发现稻-螺-小龙虾系统显著改变了微生物群落组成，增加了细菌磷脂脂肪酸、革兰氏阴性菌、厌氧菌和丛枝菌根真菌的丰度。然而，微生物群落不仅对管理措施有响应，还对由鳝鱼引起的生物扰动、有机质输入和施肥策略驱动的土壤物理结构、养分库和微生物生境的长期变化有响应——这些过程是逐渐累积的，而非立即响应，因此需要长期田间观察才能完全理解。与稻鱼和稻虾系统相比，关于稻鳝共作的长时期研究仍然特别有限，特别是在土壤物理结构、养分循环过程和微生物群落动态方面。鳝鱼在浅水环境中茁壮成长，例如沟渠和稻田，并能很好地适应环境条件。在夜间，它们离开沟渠并钻入稻田，创造出适合其栖息地的泥洞。这种持续的生物扰动可以逐渐改变土壤孔隙度、通气状况和微生境异质性，这些效应预计会随时间加剧而非立即显现。与普通鱼类相比，鳝鱼具有高经济价值和某些药用特性。此外，鳝鱼排泄物和残留饲料输入为土壤贡献有机质，促进养分循环，减少对外部氮的依赖，并通过其对土壤肥力的累积效应提高水稻生产力。同时，稻鳝系统在减少抗生素使用和管理抗生素抗性基因方面表现出显著性能，并且也可能影响杂草管理。在此框架下，关于稻鳝系统的现有研究主要持续1-4年，并主要集中在土壤养分水平、抗生素抗性基因、细菌群落组成、水质以及杂草和害虫的生物量等方面。关于土壤微生物群落、土壤物理结构和化学性质的长期影响的研究仍然相对较少。
用秸秆和有机肥替代化肥是一种广泛采用的生态农业策略。秸秆还田和施用有机肥可以优化土壤结构，促进养分循环，并减少对化肥的依赖。先前关于种养结合模型的研究已显示出积极结果，但很少有研究探索稻鳝系统与秸秆还田和有机肥施用的耦合应用。本研究利用2016年建立的长期生态稻鳝系统，考察有机肥和秸秆替代对土壤结构、养分动态和微生物群落组成的影响。具体而言，研究目标是：（1）确定在稻鳝系统中用有机质替代化肥如何影响土壤团聚体稳定性和养分动态；（2）阐明稻鳝系统下细菌和真菌群落的组成、功能潜力和空间分布；（3）确定在有机肥替代下的稻鳝系统中，特定微生物类群如何通过养分、土壤结构和微生物过程之间的动态相互作用介导土壤质量改善。研究结果预计将为优化和推广稻鳝系统作为可持续种植实践提供科学依据，该实践能增强土壤肥力、结构稳定性和微生物功能，同时减少对化肥的依赖。
2 材料与方法
2.1 试验点描述
试验于2016年5月水稻生长季节开始。每年实施一致的实践，包括水稻-休耕轮作、田间管理和施肥策略。长期稻鳝系统试验在上海市农业科学院庄行综合试验站的砂壤土上进行。该地属亚热带季风气候，年平均降雨量1241.1毫米，平均气温16.5°C。使用的水稻品种是花优14（Oryza sativa L.），鳝鱼种类是暗斑黄鳝（Monopterus albus）。土壤样品于2025年3月采集用于后续分析。
2.2 试验设计
采用随机区组设计建立了5个处理，每个处理重复3次，总共15个小区，每个小区面积4米×3米。每个小区包含一个L形沟渠，占小区面积的15%。小区用土工膜围起来，以确保肥料和水的隔离。鳝鱼在水稻苗期放入稻田沟渠中。鱼苗体重20-25克，体长27-31厘米，放养密度为100公斤·公顷-1。鳝鱼依靠天然饲料来源，如蚯蚓、昆虫和水生浮游生物，不提供补充饲料。
施肥遵循当地农业实践，RT和IRT在稻季施用300公斤·公顷-1纯氮（N）、192公斤·公顷-1磷（P2O5）和180公斤·公顷-1钾（K2O）。使用的肥料包括尿素、过磷酸钙和硫酸钾。在I70、IO和IS处理中，施用化学肥料中总纯氮的70%。在IO和IS中，剩余的30%纯氮分别用有机肥和秸秆替代。有机肥由上海欧海能源技术有限公司提供，主要由发酵稻草材料组成，含有2.51% N（N）、1.02% P（P2O5）和1.53% K（K2O）。秸秆含有0.33% N、0.19% P和1.35% K。水稻收获后，秸秆被粉碎并深翻入土壤，深度约20厘米。有机肥作为水稻基肥一次性施用。有机肥和秸秆的养分含量根据其测量值计入总肥料计算。如果磷和钾水平不足，则施用额外的化学肥料以确保所有处理的养分一致性。
2.3 土壤采样
于2025年3月使用土壤采样器采用五点采样法采集土壤样品，采样深度为0-20厘米和20-40厘米。对于每个深度，在一个小区内取五个样品并混合均匀形成一个样品，视为一个重复。每个处理共收集3个重复。采集后立即手动去除可见植物残体、根系和砾石，并放入塑料自封袋中，24小时内运至实验室。到达实验室后，一部分新鲜土壤立即在液氮中冷冻，并储存在-80°C直至DNA提取，用于高通量测序和定量PCR（qPCR）分析，以保存微生物群落结构和核酸完整性。剩余土壤在室温下风干，随后分成两部分。一部分轻轻研磨并通过10目（≥2毫米）和100目（<2毫米）筛，获得粗粒和细粒部分用于理化分析。然后将两个土壤部分分别放入无菌自封袋中。另一部分用于测定土壤团聚体特性。
采用Elliott（1986）描述的湿筛法测定不同粒径等级的土壤团聚体分布。首先，将风干土块沿其自然结构面破碎成1-2厘米直径的小块。去除可见植物残体和石块，称取50克处理过的样品进行分析。将土壤用水预湿，并均匀分布在嵌套筛组（筛孔尺寸为2、1、0.5、0.25和0.053毫米）的顶筛（2毫米）上。将筛组放入充满水的土壤团聚体分析仪中，确保筛子完全湿润。湿筛振幅为3.8厘米，振动频率为每分钟30次，持续30分钟。筛分后，将每个筛子上保留的团聚体用蒸馏水冲洗到单独的烧杯中，烘干并称重。将土壤分为六个粒径等级：>2毫米、1-2毫米、0.5-1毫米、0.25-0.5毫米、0.053-0.25毫米和<0.053毫米。计算每个粒径等级团聚体的比例及其水稳定性。
公式（1）-（3）显示了水稳性大团聚体（R0.25）、平均重量直径（MWD）和几何平均直径（GMD）的计算公式。
2.4 土壤化学性质与作物产量分析
土壤全氮（TN）采用硫酸消解法测定。全磷（TP）通过硫酸-高氯酸消解法测定。碱解氮（AN）采用凯氏消解法测定。有效磷（AP）采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法测定。土壤有机质（SOM）含量采用重铬酸钾-硫酸氧化法分析，pH采用土壤电位法（水土比2.5:1）测定。
2.5 微生物分析
使用PowerSoil? DNA分离试剂盒从0.5克土壤样品中提取DNA，遵循制造商方案。
定量PCR分析：分别使用引物对341F/806R和ITS1F/ITS2R扩增细菌和真菌群落。定量PCR（qPCR）在30微升反应体积中进行，包含15微升qPCR Mix、2微升Mg2+（25毫摩尔）、正向和反向引物各0.5微升、2微升DNA模板、0.5微升荧光染料，并用无核酸酶水补至终体积30微升。热循环条件为：95°C初始变性3分钟，随后进行34个循环（细菌）和35个循环（真菌）。每个循环包括94°C变性30秒，50°C（细菌）和59°C（真菌）退火30秒，72°C（细菌）和81°C（真菌）延伸30秒；最后72°C延伸10分钟。
高通量分析：通过对16S rRNA基因的V3-V4区域进行测序，研究稻田土壤细菌的群落结构。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）进行扩增。使用真菌特异性引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）扩增真菌内转录间隔区1（ITS1）区域。PCR条件为：94°C初始变性2分钟，随后进行35个循环（细菌）和45个循环（真菌）。每个循环包括94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒。PCR产物纯化和定量后，进行高通量测序。样品提交至上海个人生物科技有限公司，在Mesiq平台上进行测序分析，将序列（相似性大于97%）聚类为操作分类单元（OTU），随后进行注释以获得分类学信息。
2.6 统计分析
使用SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验（p < 0.05），以分析5个处理和6个养分指标（TN、TP、AN、AP、SOM、pH）的240个样品。使用SPSS 26.0进行PERMANOVA分析。使用Origin 9.0可视化养分指标和相关性分析。在Personalbio Genescloud平台上进行冗余分析（RDA）、微生物分析和可视化。
灰色关联分析（GRA）量化指标系统内因素的影响，以确定最佳处理。广泛应用于经济学、市场营销、医学、计算机科学和社会科学领域，GRA支持稳健的决策制定。在本研究中，我们应用GRA评估稻鳝系统的最佳施肥方法。我们使用10个指标和5个处理构建灰色系统，共包含50个样品。然后计算每个处理的灰色关联度，值越高表示土壤改良效果越好。灰色关联度分析的计算过程如下。
3 结果
3.1 土壤水稳性团聚体
不同处理下土壤水稳性团聚体的分布如图所示。在0-20厘米土壤中，粒径比例最大的是<0.053毫米，平均为49.25%。与RT相比，稻鳝系统显示出显著更高的0.25-0.5毫米团聚体含量，平均增加208.94%。此外，IS还显著增加了>2毫米团聚体的比例121.62%，并减少了0.5-1毫米团聚体37.56%。相比之下，与RT相比，稻鳝系统（不包括IRT）中<0.053毫米团聚体显著减少，平均减少21.36%。在20-40厘米土壤中，粒径比例最大的仍然是<0.053毫米，平均为65.80%，高于0-20厘米。与RT相比，IRT和I70下>2毫米团聚体的比例显著增加，分别增加16.34%和24.37%。IS下0.5-1毫米团聚体的比例和IO下0.25-0.5毫米团聚体的比例也分别显著增加42.44%和46.05%。此外，与RT相比，稻鳝系统中0.053-0.25毫米团聚体平均增加46.68%，而<0.053毫米团聚体平均减少10.61%。
不同施肥处理下的水稳性团聚体如图所示。与RT相比，在0-20厘米和20-40厘米土壤中，稻鳝系统普遍数值上增加了土壤R0.25、GMD和MWD。值得注意的是，在0-20厘米处，只有IO显著增加了土壤R0.25，比RT高39.88%。所有处理间的GMD和MWD无显著差异。在20-40厘米处，与RT相比，IS和IO下的R0.25和MWD显著更高，平均分别增加34.07%和22.63%。此外，IS下的GWD显著高于RT，增加22.19%。
3.2 土壤化学性质
稻鳝系统和不同施肥方法对土壤化学性质的影响如图所示。在0-20厘米土壤中，所有处理间的pH无显著差异，平均值为7.38。与RT相比，IS和IO显著增加了SOM，平均增加16.04%。IRT和IO下的TN显著高于RT，平均增加8.18%。I70和IS下的AN平均比RT低16.15%。IO的TP和AP最高，分别显著高于RT 15.05%和34.92%。SOM在IS达到峰值，显著高于RT 16.98%。相比之下，I70的SOM、TN、TP和AN值最低，分别显著低于RT 3.77%、8.73%、15.86%和20.77%。
在20-40厘米土壤中，养分含量普遍低于0-20厘米土壤。I70和IO下的平均pH显著升高至7.66，而IRT和IS下的平均pH显著降低2.68%。稻鳝系统对TN和TP无显著影响。与RT相比，IRT、IS和IO下的SOM显著增加，平均增加20.93%。与RT相比，I70和IS下的AN显著降低，分别降低6.26%和8.30%，而IS和IO下的AP平均显著高于RT 33.70%。在所有处理中，IS的SOM和AP达到峰值，分别显著高于RT 23.26%和34.78%，而I70的AP最低，显著低于RT 23.91%。
3.3 土壤微生物群落丰度与多样性
在0-20厘米土壤中，与RT相比，稻鳝系统显著增加了细菌群落的Pielou_e和Simpson指数，平均分别增加5.11%和0.43%，在IS下达到最高值，分别比RT高8.31%和0.44%。在20-40厘米处，与RT相比，稻鳝系统显著增强了细菌群落的Simpson和Pielou_e指数，平均分别增加0.19%和4.05%。与RT相比，IO达到细菌群落多样性峰值，Simpson和Pielou_e指数分别显著增加0.22%和2.48%。
在0-20厘米处，与RT相比，IRT显著增加了真菌群落的Simpson指数5.87%，而I70和IS分别显著降低了Simpson指数7.52%和6.82%。对于Pielou_e指数，IRT和IO分别显著增加15.73%和8.68%，而I70导致显著降低11.14%。在20-40厘米处，与RT相比，IRT显著降低了Simpson多样性和Pielou_e指数，分别降低9.38%和15.92%。然而，IS显著增加了Pielou_e指数10.26%。
微生物基因拷贝数的分布如表2所示。在0-20厘米处，与RT相比，IS和IO显著增加了细菌和真菌基因拷贝数，而其他处理无显著影响。具体而言，IS下细菌基因拷贝数增加26.09%，IO下增加78.65%；真菌基因拷贝数分别增加18.43%和101.44%。在20-40厘米处，微生物基因拷贝数低于0-20厘米土壤。与RT相比，稻鳝系统显著增加了细菌和真菌基因拷贝数，平均分别增加51.60%和71.42%。此外，IO达到细菌和真菌基因拷贝数峰值，分别比RT高93.38%和96.70%。
3.4 土壤微生物群落组成
两个土壤层中细菌门水平的前10名如图所示。变形菌门（Proteobacteria）（0-20厘米21.23%，20-40厘米18.82%）、绿弯菌门（Chloroflexi）（0-20厘米14.89%，20-40厘米13.34%）和酸杆菌门（Acidobacteriota）（0-20厘米14.40%，20-40厘米14.72%）在群落中占主导地位。在0-20厘米处，与RT相比，稻鳝系统显著增加了绿弯菌门（45.69-82.80%）、酸杆菌门（35.03-58.13%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）（25.24-51.87%）、MBNT15（39.03-152.82%）和脱硫菌门（Desulfobacterota）（52.62-178.54%）的相对丰度。相反，放线菌门（Actinobacteriota）和拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度分别显著降低15.12-49.11%和82.08-87.18%。对于变形菌门，I70显著增加了其相对丰度，而其他稻鳝系统处理显著降低了其相对丰度，平均比RT低12.53%。与RT相比，IRT和IO显著增加了甲基微生物门（Methylomirabilota）的相对丰度，平均增加33.68%，而I70和IS显著降低了其相对丰度，平均降低15.48%。在20-40厘米土壤中，与RT相比，稻鳝系统显著增加了酸杆菌门（27.47-119.11%）、绿弯菌门（70.79-109.62%）、芽单胞菌门（53.63-174.77%）、甲基微生物门（3.61-159.54%）、粘球菌门（Myxococcota）（21.10-109.19%）、脱硫菌门（75.02-340.74%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirota）（50.66-278.24%）和MBNT15（96.57-145.03%）的相对丰度。相反，稻鳝系统显著降低了变形菌门和放线菌门的相对丰度，平均分别降低45.87%和77.63%。
在两个土壤层中，真菌门水平的前10名如图所示。子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）在真菌群落中占主导地位。在0-20厘米处，它们在土壤真菌序列数据中的平均比例分别为81.80%和5.59%。在20-40厘米处，这些值分别增加到87.28%和8.58%。在0-20厘米土壤中，与RT相比，IO显著降低了担子菌门的相对丰度299.16%，而IS显著降低了子囊菌门42.72%，并增加了壶菌门（Chytridiomycota）234.78%。不同处理间油壶菌门（Olpidiomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）无显著差异。在20-40厘米处，与RT相比，IRT、I70和IS下担子菌门的相对丰度平均显著增加72.16%。IS和IO也显著增加了壶菌门的相对丰度，平均增加1.14%。其他真菌门在所有处理间无显著差异。
3.5 具有显著差异的特定群落
采用线性判别分析效应大小（LEfSe）来识别细菌和真菌群落的显著差异。在0-20厘米土壤中，共有34个细菌类群的LDA得分大于4。其中，12个细菌类群在RT中富集。IRT仅包含两种细菌：MBNT15和Massilia（属水平）。I70显示了9个细菌类群的富集，是稻鳝系统处理中显著差异类群数量最多的。IS和IO分别有4个和3个细菌类群。具体而言，硝化螺旋菌门（门水平）、SC_I_84（科和属水平）和热脱硫弧菌纲（Thermodesulfovibrionia）（纲水平）在IS下富集，而酸杆菌门（门水平）、硫杆菌属（Thiobacillus）（属水平）和氢噬菌科（Hydrogenophilaceae）（科水平）在IO下聚集。在20-40厘米处，54个细菌类群的LDA得分大于4。RT仍然是具有显著差异类群数量最多的处理，鉴定出19个类群。与0-20厘米土壤的结果相似，I70是稻鳝系统处理中具有显著差异类群最多的，总共有24个细菌类群。IRT和IS各包含3个类群。在IRT下，绿弯菌门（门水平）、硫杆菌属（属水平）和氢噬菌科（科水平）富集。在IS下，硝化螺旋菌门（门水平）、热脱硫弧菌纲（纲水平）和Sva0485（目水平）富集。IO只有一种细菌，即MBNT15。
在0-20厘米处，21个真菌类群的LDA得分大于4。具有显著系统发育差异的真菌群落分布为：纲水平2个，目水平5个，科水平6个，属水平4个，种水平4个。在所有处理中，I70在稻鳝系统中具有显著差异的真菌类群数量最多，有6个类群富集：座囊菌纲（Dothideomycetes）（纲水平）、Cyberlindnera（属和种水平）、法夫酵母科（Phaffomycetaceae）（科水平）和酵母目（Saccharomycetales）（目和纲水平）。IRT和IO分别聚集了4个和5个真菌类群。在IRT下，Junewangiaceae（种、属和科水平）和粪壳菌纲（Sordariomycetes）（目水平）富集。在IO下，Podosporaceae（科水平）和球盖菇科（Strophariaceae）（种、属和科水平）占主导地位。在20-40厘米处，32个真菌类群的LDA得分大于4。IRT在稻鳝系统中具有显著差异的真菌类群数量最多，有10个类群富集。I70、IS和IO分别有4、4和3个类群。葫芦霉科（Cucurbitariaceae）（科水平）、棘壳孢属（Pyrenochaetopsis）（种和属水平）和格孢腔菌目（Pleosporales）（目水平）在IS中富集。在I70下，座囊菌纲（纲水平）、枝孢属（Cladosporium）（属水平）和枝孢霉科（Cladosporiaceae）（种）显示出最显著的差异。Podosporaceae（科水平）和假暗色孢属（Pseudopithomyces）（种水平）分别在I70和IO下显示出最显著的差异。
3.6 与微生物群落相关的关键环境因素
进行冗余分析（RDA）以评估土壤理化性质与微生物群落结构之间的关系。在0-20厘米和20-40厘米土壤中，土壤性质分别解释了细菌群落
