《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Association between leukemic immunophenotype and overall survival in patients with acute promyelocytic leukemia: a retrospective cohort study
编辑推荐：
本综述通过回顾性队列研究，系统分析了72例急性早幼粒细胞白血病（APL）患者的流式细胞术（FCM）免疫表型数据，发现CD2与CD200表达是影响APL患者总体生存期（OS）的独立不良预后因素。研究揭示了APL区别于非APL-急性髓系白血病（AML）的独特免疫表型特征，为APL的精准诊断、风险分层及个体化治疗提供了重要循证依据。
1 引言
急性早幼粒细胞白血病（APL）作为急性髓系白血病（AML）的一种独特亚型，以其特异的t（15;17）（q24;q21）染色体易位产生PML-RARA融合癌基因为特征。尽管其仅占AML病例的5%–15%，但由于全反式维甲酸（ATRA）和砷剂等靶向药物的应用，其长期缓解率已超过90%，成为血液肿瘤领域治愈率最高的亚型之一。然而，早期死亡，尤其是由出血和分化综合征导致的死亡，仍是APL治疗面临的主要挑战，凸显了快速准确诊断的极端重要性。
流式细胞术（FCM）免疫表型分析在AML（包括APL）的初步诊断中不可或缺。APL原始细胞通常表现出特征性的免疫表型：高侧向角散射（SSC），CD33和CD13的强表达，HLA-DR和CD34的频繁缺失，以及CD117的可变表达。PML-RARA融合基因存在三种主要异构体（bcr1/L型，bcr3/S型，bcr2/V型），其中L型最为常见。除核心表型外，APL亚群中“异常”抗原（如CD2、CD56、CD34、CD11b、CD15、CD7和CD25）的表达也日益被报道。近期研究探索了这些异常标志物在鉴别APL与其他AML亚型方面的潜在诊断效用，及其在复发风险或早期死亡方面的预后意义。弥漫性血管内凝血（DIC）是APL常见的危重并发症。本研究中有5例APL患者在30天内早期死亡，其中4例死于DIC。已有研究提及CD56和CD34与APL中DIC的发生相关，CD56和CD2也被发现与APL的不良结局相关。然而，在现代化ATRA/砷剂治疗方案背景下，特定异常免疫表型的精确预后影响仍未完全明确，其与PML-RARA异构体类型的关系也需深入研究。
2 材料与方法
2.1 研究人群
本研究回顾性收集了2014年1月至2023年3月期间在阜阳市人民医院治疗的453例AML患者数据，其中包括72例APL患者（男性37例，女性35例），平均年龄为45.6 ± 14.3岁。非APL-AML组包括381例患者（男性242例，女性139例），平均年龄为58.9 ± 17.7岁。AML的诊断基于世界卫生组织（WHO）造血与淋巴组织肿瘤分类标准。APL患者均按照《中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南（2018年版）》接受统一治疗方案，高危患者常接受联合化疗。本研究经阜阳市人民医院伦理委员会批准，所有患者在治疗开始时均签署知情同意书。
2.2 标本制备
采集骨髓或外周血样本（2–3 mL）于肝素抗凝管中。使用的荧光标记单克隆抗体包括针对CD7、CD117、CD33、CD10、CD34、CD64、CD13、CD11b、CD2、CD123、CD4、CD25、CD15、CD56、HLA-DR、CD200、CD9、CD14、髓过氧化物酶（MPO）、CD79a、CD3、CD45等的抗体。固定破膜剂、溶血素及流式细胞仪均购自BD公司。
2.3 流式细胞术
骨髓和血细胞与抗体在室温下孵育30分钟，随后采用标准溶血/洗涤技术裂解红细胞。使用多参数流式细胞术（BD FACSCalibur）结合Cellquest软件系统分析原始细胞的抗原表达。设门采用CD45/SSC策略，以标本中的成熟淋巴细胞和成熟粒细胞作为内参。细胞表面抗原表达≥20%判定为阳性，≥80%判定为高表达。胞浆抗原表达≥10%判定为阳性。
2.4 随访
通过电话访谈、门诊随访和病例回顾评估存活患者的生存状况。末次随访时间为2023年3月1日。5年总生存期（OS）定义为从初次诊断到死亡或随访结束的时间。
2.5 统计分析
使用FreeStatisticsV2.2.0软件进行统计分析。连续变量以均数±标准差表示，分类变量以频数（百分比）表示。组间连续变量比较采用方差分析，分类变量比较采用卡方检验。采用Cox比例风险模型和Kaplan-Meier生存分析确定生存预测因素，结果以风险比（HR）及其95%置信区间（CI）表示。通过Wald检验和似然比检验评估模型的显著性。采用亚组分析和森林图检验年龄、性别、DIC和白细胞计数（WBC）的交互作用。统计学显著性定义为双侧α < 0.05。未解释的估计值（如无限置信区间）被排除在报告之外。
3 结果
3.1 研究对象基线特征
在2014年1月至2023年3月期间筛查的532例白血病患者中，最终分析队列包括72例新诊断的APL患者和381例非APL-AML患者（均具有完整的流式细胞术数据）。APL组的平均年龄（45.6 ± 14.3岁）显著低于非APL-AML组（58.9 ± 17.7岁）。两组性别分布无显著差异。在72例APL患者中，55例为PML-RARα（L型），15例为PML-RARα（S型），2例为PML-RARα（V型）。不同PML-RARα异构体组间的年龄和性别无显著差异。S型亚组的WBC中位数最高。DIC发生率在各组间无显著差异。
3.2 APL组与非APL-AML组免疫表型比较
与非APL-AML组相比，APL组CD33、CD13、CD9和MPO的表达水平显著升高，而CD7、CD34、CD56、CD38、CD200和HLA-DR的表达水平显著降低。PML-RARα（L型）与APL组的免疫表型一致。与非APL-AML组相比，PML-RARα（S型）主要表现为CD33、CD2、CD9和MPO表达增加，以及CD34、CD200和HLA-DR表达降低。与PML-RARα（L型）相比，PML-RARα（S型）的CD34、CD2和CD200水平较高。
3.3 Cox多变量回归分析免疫表型与APL患者生存时间的相关性
单变量Cox分析显示，CD34、CD2、CD56和CD200的表达均与较差的OS显著相关。经过年龄和性别调整后，CD2、CD56和CD200仍保持统计学显著性，而CD34与生存的关联消失。进一步调整年龄、性别和DIC后，多变量分析揭示CD2（调整后HR = 1.04， 95% CI： 1.01–1.07）和CD200（调整后HR = 1.04， 95% CI： 1.01–1.06）是生存率的独立相关因素，而其他免疫表型未显示显著相关性。
3.4 CD56、CD2、CD200和CD34对APL患者生存时间影响的Kaplan-Meier生存曲线
未调整的Kaplan-Meier曲线显示，CD56、CD2、CD200和CD34的阳性表达均与APL患者较差的生存率显著相关。调整年龄和性别后，CD56和CD2仍与生存率降低显著相关，CD200和CD34与生存率关联的显著性下降。进一步调整年龄、性别和DIC后，CD2和CD200的阳性表达仍与生存率降低显著相关，而CD56和CD34呈现非显著的趋势。
3.5 CD56、CD2、CD34和CD200对APL患者生存时间影响的亚组分析森林图
亚组分析显示，对于CD56，观察到与年龄存在显著交互作用，在年龄≥50岁的患者亚组中，CD56阳性导致生存时间显著缩短的风险更高。对于CD34，观察到与性别存在显著交互作用，在男性亚组中，CD34阳性导致生存时间缩短的风险显著更高。除此之外，CD56、CD2、CD34和CD200在各亚组中均未观察到显著的交互作用，表明这些标志物与APL患者生存时间的关系在不同亚组中相对稳定。
4 讨论
本研究证实了APL区别于非APL-AML的独特免疫表型特征，并详细描述了PML-RARα（L型）和（S型）的免疫表型差异。研究发现CD34、CD2、CD56和CD200的表达与APL患者的OS显著相关，其中CD2和CD200在多变量调整后仍是独立的不良预后因素。
特定免疫表型标志物相关的不良预后可能由与白血病发生和免疫逃逸相关的潜在机制解释。PML-RARα融合蛋白可能通过破坏核体、抑制分化和凋亡相关基因转录，导致CD34、CD2等标志物的异常表达。CD34作为原始造血祖细胞的标志物，常与高危疾病和复发增加相关，可能反映了具有增强自我更新能力和化疗耐药性的干细胞样表型。CD2的异常表达可能通过微环境相互作用或激活阻碍分化的信号通路促进白血病细胞存活。CD56则可能通过增强组织因子表达或内皮激活与DIC的发生相关，本研究在调整DIC后CD56与OS的关联消失支持了这一观点。CD200作为一种免疫调节分子，可能通过抑制T细胞反应促进免疫逃逸。S型PML-RARα异构体中CD34、CD2和CD200的较高表达可能部分解释了该亚型患者生存较差的现象。
肿瘤免疫微环境在APL进展和治疗应答中起关键作用。本研究发现CD56与年龄、CD34与性别之间存在交互作用，提示这些标志物的预后影响可能受宿主因素和免疫背景的调节。针对这些通路，例如在AML中应用抗SLAMF6抗体，可能成为高危APL亚群有前景的治疗策略。
本研究存在一些局限性。首先，其观察性设计无法阐明因果关系或完全排除未测量混杂因素的影响。未来可考虑采用孟德尔随机化（MR）等因果推断框架进行验证。其次，研究对象均来自单一医疗中心，回顾性数据收集可能存在选择偏倚。第三，样本量相对较小，尤其对于PML-RARα（V型）等罕见亚型，且缺乏复发/微小残留病数据。
未来需开展多中心、前瞻性队列研究，并积累更大样本量，以验证当前结论，并深入探索这些标志物影响信号通路、免疫逃逸和治疗耐药的机制，从而为开发新的治疗靶点和构建整合免疫表型的预后模型奠定基础。
5 结论
与非APL-AML患者相比，APL患者（PML-RARα（S型）和PML-RARα（L型））表现出独特的免疫表型变化。白血病细胞中CD56、CD2、CD34和CD200的表达频率与APL患者的OS显著相关，治疗前这些指标的高表达可能是APL患者的不良预后因素。
