无外源异种成分的视网膜投射组装体生成：构建人类视觉通路疾病模型的新策略

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Generation of xenobiotic free retinofugal assembloids

本综述系统介绍了无外源异种成分（xenobiotic-free）条件下生成视网膜-皮质组装体（retinofugal assembloids）的前沿方案。文章重点阐述了该技术在模拟视网膜神经节细胞（RGCs）发育、轴突导向及髓鞘形成过程中的独特优势，为研究青光眼、多发性硬化（MS）相关视神经炎等视神经病变提供了高度人源化的三维疾病模型，显著提升了临床转化研究的科学严谨性。

　　

引言：视网膜神经节细胞作为视觉通路的核心

视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）是视网膜中唯一的输出神经元，承担着将视觉信号通过视神经传递至大脑的关键功能。这类细胞具有长轴突、高代谢需求的特点，且其轴突需要穿越不同的微环境，使得它们在对青光眼、多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）相关的视神经炎（Optic Neuritis, ON）等视神经病变中显得尤为脆弱。这些病变的病因涉及氧化应激、兴奋性毒性以及神经视网膜或视神经内的炎症损伤等机制。

尽管动物模型在揭示疾病病理生物学方面发挥了重要作用，但其难以完全复现人类疾病的复杂性。传统的二维（2D）培养模型，包括RGC单一培养和与胶质细胞（如星形胶质细胞和小胶质细胞）的共培养体系，虽便于研究细胞间信号传导和药物反应，但无法模拟体内三维微环境、分子梯度及组织结构。三维（3D）器官样体模型在结构背景上有所改进，但仍缺乏关键细胞类型和足够的解剖复杂性。特别值得注意的是，模拟MS相关ON需要再现视神经的脱髓鞘过程，而这一过程离不开少突胶质细胞（oligodendrocytes）的参与，但少突胶质细胞在单纯的视网膜器官样体中并不存在。此外，这些系统中广泛使用的动物源性试剂可能引入显著的表型变异，成为转化研究的主要障碍。

为了应对这些挑战，视网膜投射组装体（retinofugal assembloid）模型应运而生。这类模型通过融合视网膜器官样体和脑区器官样体（如皮质、丘脑器官样体），旨在体外复现体内视觉通路，支持RGC的存活、轴突延伸与路径寻找，并整合更多的胶质细胞类型，从而提供足够的复杂性。本文详细描述了在无外源异种成分条件下，从人多能诱导干细胞（iPSCs）生成富含少突胶质细胞的皮质器官样体和视网膜器官样体，并将其融合成组装体的逐步方案，以期在更贴近人体的微环境中模拟RGC生理病理过程。

材料与方法：构建无外源异种成分的培养体系

细胞系与试剂

研究采用了健康供体来源的人iPSC系（ACS-1026）以及携带Brn3-GFP报告基因的转基因iPSC系，后者便于示踪RGCs。所有培养试剂均力求无外源异种成分，例如使用符合cGMP标准的TrypLE Select酶进行细胞消化，培养基中添加人血清替代胎牛血清，并使用重组人源细胞外基质（ECM）混合物。

关键培养基的配制包括：

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  球状体起始培养基（Spheroid Starter Medium, SSM）：用于诱导初期神经分化，含有背形态发生素（Dorsomorphin，BMP信号通路抑制剂）和SB-431542（TGF-β信号通路抑制剂）进行双重SMAD抑制。
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  神经基础培养基（Neurobasal Medium, NB）：用于神经细胞维持与分化，可根据不同分化阶段添加特定的生长因子，如脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养因子-3（NT-3）、血小板衍生生长因子-AA（PDGF-AA）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和三碘甲状腺原氨酸（T3），以分别促进神经元存活、突触发生、少突胶质前体细胞（OPC）扩增/成熟以及少突胶质细胞髓鞘化。
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  三维分化培养基（3D differentiation medium）和神经视网膜培养基（Neural Retina medium）：专门用于视网膜器官样体的定向分化，其中添加骨形态发生蛋白4（BMP4）以诱导视网膜命运。

iPSC的培养与传代

iPSC使用mTeSR Plus培养基进行维持，并通过每日观察手动去除自发分化的细胞。传代时采用Versene（一种EDTA为基础的解离试剂）进行集落样传代，以最大限度保持细胞间连接，减少单细胞解离带来的自发分化，有助于维持多能性。用于下游分化的iPSC代次均低于50代。

少突胶质细胞富集的皮质器官样体的生成

分化流程历时约70天：

1. 1.
   第0-2天：iPSC准备：将iPSC用TrypLE消化成单细胞，以每孔10,000个细胞的密度接种在96孔V底板（超低吸附）中，离心促进球状体形成。
2. 2.
   第3-70天：球状体分化：
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     第3-7天：在SSM中进行双重SMAD抑制，诱导神经定向。需注意背形态发生素的浓度需根据细胞系进行优化（通常1-10 μM），以避免细胞毒性。
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     第8-23天：转换至含表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）的NB培养基，促进神经上皮增殖。
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     第25天：将球状体转移至超低吸附6孔板或10厘米培养皿中。
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     第28-39天：添加BDNF和NT-3，支持神经元成熟和突触发生。
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     第42-49天：撤去生长因子，使细胞环境简化。
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     第50-58天：添加PDGF-AA和IGF-1，诱导少突胶质细胞谱系定向和成熟。
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     第60-67天：添加T3，进一步促进少突胶质细胞髓鞘化。
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     第70天起：在基础NB培养基中维持。

视网膜器官样体的生成

分化流程约50天：

1. 1.
   第0-2天：iPSC准备：将iPSC消化成单细胞，以每孔4,000个细胞的密度接种。
2. 2.
   第3-40天：视网膜杯形成：
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     第6天：添加BMP4诱导视网膜命运。
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     第8-15天：通过半换液逐渐降低BMP4浓度。
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     第16天：将器官样体转移至超低吸附板，换用神经视网膜培养基。
   • •
     第30-40天：识别并手动解剖神经上皮“杯”状结构，富集视网膜组织。
3. 3.
   第40天后维持：定期更换神经视网膜培养基。

组装体培养的建立

在第70天，将表达Brn3-GFP的视网膜器官样体用无菌手术刀片剖开，将其切面与经过Di-I荧光染料标记的少突胶质细胞富集的皮质器官样体在低吸附12孔板中接触。将培养板一侧垫高呈约45°角，依靠重力使两个器官样体紧密靠拢，静置3天促进融合。组装体在神经视网膜培养基中继续培养。

成像与免疫荧光分析

活体成像时，使用碘克沙醇（Iodixanol）调整培养介质的折射率，以提高分辨率和成像深度。固定后的组织进行冷冻切片，并通过免疫荧光染色鉴定特定细胞类型，使用的标志物包括：Nestin（神经前体细胞）、βIII-微管蛋白（TUBB3，成熟神经元）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞）和髓鞘碱性蛋白（MBP，成熟少突胶质细胞）。

结果：成功构建功能化的视觉通路组装体

少突胶质细胞富集的皮质器官样体中的髓鞘化

通过上述无外源异种成分方案，能够稳定地生成形态紧凑、均一的皮质球状体。在70天的分化过程中，球状体经历了明确的神经发育阶段。免疫荧光染色证实器官样体内存在Nestin阳性的神经前体细胞、TUBB3阳性的成熟神经元以及GFAP阳性的星形胶质细胞。更重要的是，观察到MBP阳性的少突胶质细胞，其突起与TUBB3阳性的轴突紧密相邻，提示存在活跃的髓鞘形成过程。尽管MBP表达在某些区域呈现“斑片状”，表明髓鞘化可能不完全，但这无疑证明了该方案能够产生具备髓鞘化潜能的少突胶质细胞。

具有精确结构和迁移性RGC轴突的无外源视网膜器官样体

利用Brn3-GFP报告基因iPSC系，成功在无外源成分条件下生成了视网膜器官样体。到第21天，GFP阳性的RGCs开始出现，并在第32天时在器官样体内表面形成致密的细胞层，模拟了体内视网膜神经节细胞层的空间组织。到第50天，RGC轴突广泛延伸并环绕器官样体表面，共聚焦显微镜下可见轴突投射和生长锥，提示活跃的路径寻找行为。

模拟无外源成分组装体中的视网膜-皮质连接性

将成熟的Brn3-GFP阳性视网膜器官样体与Di-I标记的少突胶质细胞富集的皮质器官样体组装后，观察到RGC轴突在组装后第3天开始向皮质器官样体表面和实质内迁移。到第7天，轴突能够穿越约2毫米直径的皮质器官样体，迁移速率估计约为300微米/天。轴突既可单独延伸，也可成束迁移，并且迁移方向是单向的，即从视网膜器官样体指向皮质器官样体，表明存在内在的方向性引导线索。活体成像显示了密集的RGC轴突束环绕并穿透皮质器官样体。

讨论与意义：迈向更精准的人类疾病模型

本研究建立的方案成功模拟了视网膜投射通路的关键方面。无外源成分的培养体系消除了动物源性试剂带来的变异和免疫刺激风险，增强了模型的生理相关性和临床转化潜力。与需要特殊设备（如微流体芯片）的复杂系统相比，本方案更注重简化培养条件和可重复性，便于广泛采用。

然而，该研究也存在一些局限性。目前的结果多基于定性观察（如标志物表达、轴突迁移），缺乏对细胞类型比例、功能成熟度（如突触传递、电活动）、以及髓鞘超微结构的定量验证。Brn3-GFP报告基因虽便于示踪RGC，但无法区分所有RGC亚型，也无法排除视网膜器官样体中非目标性Brn3表达的可能性。此外，人血清尽管经过过滤去除不溶性颗粒以减少批间差异，但其成分的复杂性仍是需要关注的因素。

研究局限与未来方向

未来的工作将集中于以下几个方面：

1. 1.
   深入表征：利用单细胞转录组学精确鉴定器官样体和组装体中的细胞类型组成和分化状态；通过电生理学、钙成像和超微结构分析（如电子显微镜）验证神经元功能活动、突触连接以及髓鞘的超微结构。
2. 2.
   增加复杂性：引入丘脑器官样体以更准确地模拟视觉通路；整合iPSC来源的小胶质细胞，研究神经炎症和免疫应答在视神经病变中的作用。
3. 3.
   疾病建模：利用该平台模拟青光眼、MS、MOGAD、NMOSD等视神经病变，例如通过施加炎症因子、患者来源的自身抗体或脱髓鞘损伤剂。
4. 4.
   应用拓展：该无外源成分平台为高通量药物筛选、神经毒性环境因素评估以及基于细胞替代疗法（如RGC或少突胶质细胞移植）的开发提供了符合良好生产规范（GMP）方向的宝贵工具。

总之，本文描述的无外源成分视网膜投射组装体生成方案，为在高度人源化的体外环境中研究视觉系统发育、生理及疾病机制奠定了坚实基础，有望推动对视神经病变新治疗策略的探索。