《Materials Today Bio》：Multifunctional Bilayer Scaffolds Integrating Melt Electrowriting Fibers and Drug-Loaded Microspheres Promote Osteochondral Regeneration through PI3K–AKT–Mediated Chondro-Osteogenic Signaling
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本研究针对骨软骨缺损修复中结构异质性和免疫微环境调控的挑战，开发了一种整合熔融电写支架与功能化水凝胶微球的双层复合材料。上层微球负载KGN脂质体促进软骨形成，下层微球负载Cur脂质体诱导成骨并抗炎抗氧化。该系统展现可控药物释放、良好力学性能及分层调控能力，通过激活PI3K–AKT通路协同促进软骨-骨一体化再生，为大面积骨软骨缺损提供具临床转化潜力的修复策略。
关节软骨损伤后自我修复能力极差，一旦发生全层缺损，往往进展为骨关节炎，导致关节功能丧失。当前临床手段如微骨折术或自体软骨移植，虽能部分修复软骨表层，却难以重建软骨与软骨下骨之间的异质结构界面，更无法有效调控缺损区内的免疫微环境。这成为制约骨软骨再生疗效的瓶颈问题。
针对这一挑战，南京医科大学附属南京第一医院骨科团队在《Materials Today Bio》上发表研究，设计出一种仿生双层支架系统。该研究巧妙融合熔融电写技术构建的微纤维骨架与两种功能化水凝胶微球，上层微球封装kartogenin脂质体定向诱导软骨形成，下层微球负载姜黄素脂质体协同促成骨、抗氧化及抗炎。这种"钢筋混凝土"式复合结构既提供力学支撑，又实现区域特异性药物控释。
研究关键技术方法包括：采用微流控技术制备单分散水凝胶微球；通过熔融电写打印聚己内酯/聚乳酸-羟基乙酸共聚物三维支架作为承载骨架；利用脂质体包封疏水性药物提升载药效率与生物利用度；通过大鼠股骨髁缺损模型进行体内疗效验证。
3.1. 水凝胶微球与三维支架系统的表征
研究人员成功制备出形态均一、粒径可控的上下两层水凝胶微球。扫描电镜显示微球表面光滑，下层因掺入纳米羟基磷灰石呈现多孔粗糙结构。流变学测试证实微球具良好可注射性和自愈合能力。降解实验表明微球在酶或氧化应激条件下释放加速，实现微环境响应性释药。将微球填充至三维打印支架后，复合体系机械强度显著提升，宏观形状保持良好。
3.2. 药物递送系统浓度筛选
通过细胞毒性试验确定KGN和Cur的安全工作浓度分别为10 μM。该浓度下，KGN有效促进糖胺聚糖沉积，Cur在氧化应激模型中最佳保护细胞活性。
3.3. 水凝胶微球的体外生物相容性评价
钙黄绿素AM/PI染色、细胞骨架染色和扫描电镜结果一致表明，载药与未载药微球均与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性，细胞在微球表面贴附良好并伸展充分。
3.4. 水凝胶微球促进骨髓间充质干细胞迁移的能力评价
划痕实验与Transwell实验显示，载KGN的上层微球和载Cur的下层微球分别通过化学趋化与抗氧化机制，显著增强骨髓间充质干细胞的迁移能力，为缺损区募集修复细胞奠定基础。
3.5. 上层水凝胶微球的软骨形成分化能力评价
阿辛蓝染色、免疫荧光和RT-qPCR分析证实，载KGN微球通过上调SOX9和ACAN表达，显著促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，并增强II型胶原和蛋白聚糖的合成。
3.6. 下层水凝胶微球的成骨分化能力评价
碱性磷酸酶染色、茜素红染色及成骨基因检测表明，载Cur微球通过早期提升RUNX2表达和后期促进钙结节形成，协同纳米羟基磷灰石的成骨诱导作用，显著增强骨髓间充质干细胞的成骨分化。
3.7. 水凝胶微球的抗氧化和抗炎特性评价
DPPH自由基清除实验和DCFH-DA染色显示，两层微球均能有效清除活性氧。流式细胞术与免疫荧光进一步揭示，载Cur微球可调控巨噬细胞由促炎M1型向抗炎M2型极化，降低肿瘤坏死因子-α等炎性因子表达，改善修复微环境。
3.8. 微球-支架复合体系的协同效应验证
将微球与三维支架整合后，复合体系保持微球原有的生物活性，同时获得更优的力学性能和形状稳定性。细胞实验表明复合材料仍能有效促进软骨/成骨分化，且支架未明显影响药物释放动力学。
3.9. 转录组学分析与通路验证
RNA测序发现，载KGN微球主要激活PI3K–AKT–mTOR–S6K–SOX9信号轴驱动软骨形成；载Cur微球则通过PI3K–AKT–GSK3β–β-连环蛋白–RUNX2通路促进成骨，并抑制BAX表达减少凋亡。通路抑制剂实验证实PI3K–AKT在双向分化中的核心枢纽作用。
3.10. 体内生物相容性与影像学分析
大鼠股骨髁缺损模型植入12周后，Micro-CT三维重建显示，双层支架组骨体积分数、骨矿物密度等参数显著优于空白组和单层支架组，新生组织与宿主骨整合良好。组织学评分证实其再生组织最接近正常透明软骨结构。
3.11. 组织学染色分析
苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色和天狼星红偏振光检查显示，双层支架组缺损区形成连续透明的类透明软骨层，表面光滑，潮线结构重建，胶原纤维呈典型表层平行、深层垂直的定向排列，结构与正常软骨最为接近。
3.12. 体内免疫荧光分析
免疫荧光染色进一步证实，双层支架组软骨区II型胶原高表达，软骨下骨区RUNX2阳性，而基质金属蛋白酶13和半胱天冬酶3表达显著降低，表明其有效促进基质合成的同时抑制了组织降解和细胞凋亡。
该研究通过仿生设计实现骨软骨缺损的结构性修复与功能性重建。双层复合材料不仅模拟了软骨-骨界面的机械梯度与化学异质性，更通过时空控释药物精准调控细胞命运与免疫微环境。其揭示的PI3K–AKT通路协同调控机制为复杂组织再生提供新思路，所构建的平台技术有望推广至其他梯度组织工程领域。
