《Plant Physiology and Biochemistry》：Multi-omics analysis reveals immune responses in tobacco leaves treated with polyethylene nanoparticles
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本研究针对纳米塑料（NPs）作为新兴污染物对植物的生态风险问题，通过整合转录组、蛋白质组、代谢组和磷酸化蛋白质组等多组学技术，系统分析了烟草叶片在短期暴露于聚乙烯纳米颗粒（PE-NPs）后触发的免疫响应。研究发现，20 nm PE-NPs能快速诱导烟草气孔关闭、活性氧（ROS）积累、MAPK磷酸化及病程相关（PR）基因上调，其响应模式与病原菌Pseudomonas syringae触发的模式触发免疫（PTI）高度相似。研究揭示了PE-NPs作为一种非生物激发子，通过重塑蛋白质磷酸化网络激活植物先天免疫的新机制，为理解NPs的生态效应提供了新视角。
在当今塑料污染日益严重的背景下，纳米塑料（Nanoplastics, NPs）作为一种新兴环境污染物，对生态系统和人类健康构成潜在威胁。自20世纪50年代以来，全球已生产超过83亿吨塑料，其中大量塑料废弃物进入环境，逐渐降解为微米乃至纳米级别的塑料颗粒。这些NPs可被植物根系或叶片吸收，并在组织内积累，进而影响植物生长发育、光合作用及营养代谢，甚至引发氧化损伤和基因毒性。然而，以往研究多关注NPs长期暴露的毒性效应，对其是否可能作为一种非生物激发子，触发植物先天免疫系统快速响应的认识仍十分有限。
为了解决这一问题，研究人员以烟草（Nicotiana tabacumL. cv. Yunyan 87）为模型，选取20纳米聚乙烯纳米颗粒（PE-NPs）作为代表性NPs，并以致病菌Pseudomonas syringaepv. tabaci yuexi-1（作为病原相关分子模式PAMPs阳性对照）为比较，开展了一项为期1小时的短期暴露实验。通过整合转录组学、蛋白质组学、代谢组学和磷酸化蛋白质组学分析，系统揭示了烟草叶片对PE-NPs的快速免疫响应特征及其与经典PTI的异同。
研究发现，PE-NPs处理1小时后即可诱导烟草气孔显著关闭，同时伴随活性氧（ROS）水平升高、MAPK3/6磷酸化激活以及多个病程相关（PR）基因和防御相关基因（如NtEAH (CYP71D20)、5EAS (AF542544)、HMGRL (AF004233)等）表达上调。这些反应与P. syringae触发的PTI典型特征高度一致。多组学整合分析进一步显示，在转录组和蛋白质组水平，PE-NPs与P. syringae处理均显著影响了植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成等防御相关通路，表明二者在激活核心免疫网络方面具有高度相似性。
然而，在代谢组水平，两种处理却展现出明显差异。PE-NPs特异性影响了精氨酸和脯氨酸代谢、丁酸酯代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路；而P. syringae则独特地富集了精氨酸生物合成、β-丙氨酸代谢、烟酸盐和烟酰胺代谢等途径。尤为重要的是，磷酸化蛋白质组分析揭示，PE-NPs处理诱导了更广泛的蛋白质磷酸化修饰事件，其差异磷酸化蛋白（DPPs）数量较差异表达蛋白（DEPs）多出75%，远高于病原菌处理组。这些磷酸化事件显著富集于磷脂结合、水通道活性、网格蛋白结合、泛素特异性蛋白酶结合、Hsp70蛋白结合等PTI相关分子功能。例如，质膜水通道蛋白PIP2（A0A0A8WH11）在PE-NPs处理下发生显著去磷酸化，这与flg22诱导的气孔关闭机制相吻合。
关键实验技术包括：利用扫描电子显微镜（SEM）确认PE-NPs粒径与形貌；通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记PE-NPs在叶片中的定位；采用植物过氧化氢检测试剂盒测定H2O2水平；通过蛋白质印迹（Western blot）分析MAPK3/6磷酸化水平及非特异性脂质转移蛋白2（Q03461）表达；基于高通量测序平台（MGI-T7或Illumina）进行转录组（RNA-seq）分析；利用timsTOF_HT质谱仪进行非标记定量蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析；通过超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）开展非靶向代谢组学检测。
3.1. PE-NPs和P. syringae诱导烟草气孔关闭
研究人员首先观察到，PE-NPs处理1小时即可引起烟草气孔开度显著减小，其效果与P. syringae处理相似。同时，叶片内H2O2水平显著升高，MAPK3/6磷酸化在0.5小时达到峰值。qRT-PCR结果进一步证实多个PR基因及防御相关基因表达上调。这些结果表明PE-NPs能够快速激活烟草的PTI样防御反应。
3.2. 转录组分析显示PE-NPs和P. syringae处理下基因表达模式相似
转录组分析发现，PE-NPs处理组共有3850个基因上调和4099个基因下调，与P. syringae处理组存在1884个共同上调基因和2093个共同下调基因。KEGG富集分析显示，两组处理均显著影响植物-病原互作、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导等防御相关通路。值得注意的是，WRKY转录因子、乙烯响应因子、受体样激酶（RLKs）、钙信号通路基因等PTI关键调控元件在两组中均被诱导表达。然而，MAPK级联反应存在差异：MPK9 (LOC107828435)是唯一在两组中共同诱导的MAPK基因。
3.3. 蛋白质组分析表明对PE-NPs和P. syringae的响应存在相似性
蛋白质组学鉴定到6425个蛋白质，其中PE-NPs处理特异性诱导139个蛋白上调和188个下调，P. syringae处理特异性诱导419个上调和582个下调，而48个蛋白在两组中共同上调（包括非特异性脂质转移蛋白2），131个共同下调。GO富集分析显示，两组共同影响的31个分子功能中，14个与植物胁迫和防御相关，其中10个功能在两组中呈现相似响应模式。
3.4. PE-NPs与P. syringae相比改变了烟草叶片代谢组
代谢组学检测到PE-NPs处理组2137个代谢物特征上调和2375个下调，而P. syringae处理组变化更为显著（6585个上调和4308个下调）。在化合物鉴定层面，PE-NPs处理组中51个化合物上调和77个下调，P. syringae处理组150个上调和161个下调。通路富集分析显示，仅谷胱甘肽代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢在两组中共同富集，而精氨酸和脯氨酸代谢等通路仅对PE-NPs响应，精氨酸生物合成等通路仅对病原菌响应。
3.5. 转录组、蛋白质组和代谢组水平响应的趋同与发散
整合分析发现，蛋白质表达与其mRNA转录水平相关性很弱（R2= 0.001），表明存在广泛的转录后调控。15条通路在三个组学层面均被富集，显示协调的系统性响应。56条通路在转录组和蛋白质组层面富集但未在代谢组中体现，暗示这些过程可能受转录后和/或翻译后调控。特别值得注意的是，一组可能发生磷酸化、糖基化、脂化、泛素化、乙酰化等翻译后修饰（PTMs）的蛋白在两组处理中均发生改变，但其mRNA水平无显著变化。
3.6. 磷酸化蛋白质组分析表明对PE-NPs和P. syringae的响应存在差异
磷酸化蛋白质组学共鉴定到12855个磷酸化位点，对应3568个蛋白质编码基因。PE-NPs处理组中317个蛋白磷酸化水平升高，624个降低；P. syringae处理组418个升高，610个降低。整合分析显示，PE-NPs处理组中DPPs数量较DEPs多75%，而病原菌处理组中两者数量相当。GO富集分析发现，PE-NPs处理组中28个分子功能被富集（11个与PTI相关），P. syringae处理组31个被富集（8个与PTI相关）。两组共同富集的PTI相关分子功能包括磷脂结合、水通道活性、网格蛋白结合等。Western blot验证了水通道蛋白PIP2在PE-NPs处理下去磷酸化的现象。
3.7. 多组学分析进一步揭示防御响应相关代谢途径的趋同与发散
通过将转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据映射到KEGG代谢通路，研究发现磷酸化修饰在植物激素信号转导、谷胱甘肽代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢中呈现差异调控模式。在植物激素信号转导中，脱落酸信号通路中的ABF转录因子和乙烯信号通路中的EIN2蛋白发生特异性磷酸化修饰。这些差异磷酸化事件可能是导致两种激发子触发不同代谢谱的重要原因。
本研究通过多组学整合分析，首次系统揭示了PE-NPs作为一种非生物激发子，能够激活烟草叶片的PTI样免疫响应。研究发现，PE-NPs在转录组和蛋白质组水平诱导了与病原菌P. syringae相似的防御反应，包括气孔关闭、ROS爆发、MAPK激活及防御基因表达上调。然而，在代谢组和磷酸化修饰层面，PE-NPs触发了独特的响应模式，尤其是诱导了更广泛的蛋白质磷酸化网络。这些磷酸化事件可能通过调控关键酶活性，重塑基因表达谱，最终导致独特的代谢产物谱。
该研究的重要意义在于：首先，提出了NPs可能作为"类PAMP"激发子激活植物先天免疫的新观点，拓宽了对NPs生态效应的认识；其次，揭示了蛋白质磷酸化在NPs诱导的植物免疫中的核心调控作用，为理解NPs的分子作用机制提供了新视角；最后，研究建立的短期暴露模型和多组学整合分析策略，为评估其他纳米污染物的生态风险提供了方法论参考。未来研究应着重鉴定植物识别PE-NPs的受体蛋白，阐明早期信号转导事件，并评估长期免疫激活对植物生长和生态系统功能的潜在影响。
