多中心比较LC-MS/MS、放射免疫测定法和ELISA在检测唾液中的孕酮和雌二醇方面的效果

《Psychoneuroendocrinology》：Multicenter comparison of LC-MS/MS, radioimmunoassay, and ELISA for assessment of salivary progesterone and estradiol

准确测量唾液中的黄体酮（P4）和雌激素（E2）对研究月经周期影响至关重要，但不同检测方法存在差异。本研究比较了LC-MS/MS、RIA和ELISA三种方法在120名参与者中的表现，结果显示LC-MS/MS在准确性、可靠性和低浓度检测上显著优于其他两种方法，而ELISA存在高估激素水平问题，RIA受交叉反应影响。通过多实验室分析，验证了LC-MS/MS作为黄金标准的前景。

　　
本研究针对唾液中孕酮（P4）和雌二醇（E2）的检测方法进行了系统性比较，重点评估了液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、放射免疫分析法（RIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）的性能差异。研究通过多中心、多方法的交叉验证设计，收集了来自120名参与者的336份唾液样本，涵盖不同性别、昼夜时间节律、月经周期阶段（早卵泡期与黄体期）以及口服避孕药使用情况，旨在揭示不同检测技术在复杂样本中的适用性。

**研究背景与核心问题**
当前，性激素的唾液检测在心理学与神经内分泌学研究中广泛应用，但其准确性备受争议。传统方法如ELISA和RIA因特异性不足、灵敏度受限等问题，可能高估激素浓度，尤其在低浓度范围（如男性、儿童或绝经后女性）。近年来，LC-MS/MS因高灵敏度和抗干扰能力被视为金标准，但其在实际应用中的成本效益和操作复杂性仍待验证。本研究通过横向对比三种方法，旨在明确不同技术在不同场景下的优劣。

**实验设计与质量控制**
研究采用交叉设计，将样本分配给四家实验室（心理学、儿科、心理学和心理学领域），分别使用LC-MS/MS、RIA和ELISA进行检测。样本采集覆盖晨间与晚间时段，以及月经周期关键阶段（早卵泡期第3-5天与黄体期第21-23天）。质量控制样本包含重复性样本（14份）和参考标准品（Lyphochek稀释液，4种浓度梯度），用于评估方法的精确度、回收率和实验室间一致性。

**关键发现与对比分析**
1. **孕酮（P4）检测**
三种方法均能捕捉月经周期中的自然波动，但仅在LC-MS/MS和RIA中观察到晨间与晚间浓度差异（P4通常保持稳定）。值得注意的是，所有免疫分析技术（IA）均检测到P4的异常昼夜下降，这与已知的生理规律相悖。LC-MS/MS与RIA在实验室间及方法间的一致性（r≥0.92）显著优于ELISA，表明前者更可靠。

2. **雌二醇（E2）检测**
E2的检测呈现显著技术依赖性：仅LC-MS/MS和RIA能准确反映月经周期中的自然升高（早卵泡期→黄体期）。ELISA和RIA在低浓度E2检测中表现不佳，相关系数甚至低于0.70（ deemed insufficient for reliable measurement）。LC-MS/MS在低浓度（0.5 pg/mL）仍能保持高精度，而传统IA在低浓度时因交叉反应（如与雄激素结构相似物）导致数据失真。

3. **方法间系统性偏差**
ELISA和RIA普遍显示激素浓度高估（尤其P4），且实验室间差异显著（p<0.00001）。例如，LC-MS/MS测得P4均值显著低于ELISA（约15-20%偏差），而E2的偏差幅度更大（可达30%）。尽管RIA与LC-MS/MS在P4检测中表现接近，但前者存在部分交叉反应问题，可能影响长期实验的稳定性。

4. **质量控制的启示**
通过Lyphochek参考品验证，LC-MS/MS的回收率稳定在85-115%区间，而ELISA和RIA的回收率波动范围更大（部分样本回收率不足70%）。重复样本分析显示，LC-MS/MS的日内和日间变异系数（CV）均低于5%，而IA技术CV值普遍超过15%，尤其在E2低浓度时差异显著。

**方法论局限与改进方向**
尽管LC-MS/MS在精度和可靠性上占据优势，但其设备成本高、操作复杂且需专业人员维护。研究指出，在实验室资源充足且样本浓度较高（如黄体期E2）时，RIA可作为次优选择。然而，IA的局限性在低浓度样本中尤为突出，例如男性唾液样本中的E2检测可能完全失效。此外，研究未深入探讨不同实验室间的操作差异（如样本预处理、仪器校准频率），未来需通过标准化操作流程（SOP）进一步缩小实验室间误差。

**实际应用建议**
研究团队提出了三阶段筛选标准：
- **高可靠性（r≥0.80）**：适用于临床诊断和纵向研究（LC-MS/MS、部分高质量RIA）
- **中等可靠性（0.70≤r<0.80）**：仅限短期行为研究（如昼夜节律分析）
- **低可靠性（r<0.70）**：不建议用于激素浓度预测或生理机制研究（ELISA、部分RIA）

对于需要区分月经周期阶段的研究，建议优先采用LC-MS/MS或RIA组合检测，而ELISA应仅作为补充手段。在样本浓度极低（如绝经后女性）时，LC-MS/MS的检测下限（0.5 pg/mL）显著优于传统IA（通常需＞5 pg/mL）。

**学科影响与后续方向**
该研究呼应了《临床内分泌学与代谢》期刊近年来的政策调整，即要求性激素检测必须包含LC-MS/MS验证。然而，研究也承认当前IA技术并非完全无用，在特定条件下（如高浓度样本、短期实验）仍可发挥成本效益优势。未来研究可聚焦于：
1. 开发快速LC-MS/MS检测模块以降低操作成本
2. 建立IA检测的优化阈值（如样本预处理方法）
3. 模拟不同基质干扰（如口腔细菌、食物残留）下的方法稳定性

**伦理与开放科学实践**
研究严格遵循赫尔辛基宣言，所有参与者均签署知情同意书。数据已通过OSF平台（DOI:10.17605/OSF.IO/EVPGH）完全公开，分析方法脚本同步发布，符合《心理学与神经内分泌学》期刊2024年的开放科学政策要求。此外，质量控制样本的匿名处理和盲法检测设计有效避免了实验室偏倚。

**总结**
本研究通过大规模多中心验证，确立了LC-MS/MS在唾液激素检测中的不可替代地位，尤其适用于低浓度检测和月经周期动态研究。同时为IA技术设置了明确的适用边界，为心理学与神经内分泌学领域的方法选择提供了循证指南。这一成果不仅优化了现有检测流程，更为性别差异研究、口服避孕药影响评估等细分领域提供了方法论支撑。