《Scientific Reports》：Integrated proteomics and metabolomics reveal phytosesquiterpene lactones inhibit TNBC cell activity by depleting ATP synthesis and reprogramming primary metabolism
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本研究针对三阴性乳腺癌（TNBC）治疗挑战，通过整合蛋白质组学与代谢组学，揭示了植物倍半萜内酯DET及其衍生物DETD-35通过上调SOD1/SOD2诱导线粒体超氧化物产生、促进线粒体通透性转换孔（mPTP）开放、抑制ATP合成酶（ATP synthase）活性，从而耗竭ATP合成、干扰线粒体生物能量代谢并重编程初级代谢，最终抑制TNBC细胞活性的新机制。该发现为开发靶向线粒体代谢的TNBC治疗策略提供了新视角。
三阴性乳腺癌（TNBC）因其缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达，成为乳腺癌中侵袭性强、预后差且治疗选择有限的亚型。尽管化疗仍是其主要治疗手段，但耐药性和副作用问题突出。因此，探寻具有新颖作用机制的高效低毒抗TNBC药物至关重要。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能紊乱，特别是氧化磷酸化（OXPHOS）过程受阻和活性氧（ROS）失衡，已成为一个有潜力的抗癌靶点。在此背景下，源自药用植物地胆草（Elephantopus scaber L.）的天然倍半萜内酯脱氧地胆草素（Deoxyelephantopin, DET）及其半合成衍生物DETD-35，因其在多种癌症模型中显示出显著活性而备受关注。先前研究表明，它们能诱导TNBC细胞发生氧化应激介导的副凋亡样死亡和线粒体DNA损伤，但其对TNBC细胞线粒体蛋白质组和OXPHOS代谢的具体影响尚不清楚。发表在《Scientific Reports》上的这项研究，旨在深入揭示DET和DETD-35通过干扰线粒体功能抑制TNBC细胞活性的精细分子机制。
研究人员综合运用了多种关键技术方法：包括使用MitoSOX荧光探针和钙黄绿素AM/CoCl2+淬灭法分别检测线粒体超氧化物水平和线粒体通透性转换孔（mPTP）开放；通过Seahorse XFp细胞线粒体压力测试实时监测氧消耗率（OCR）以评估线粒体呼吸功能；利用免疫捕获法测定ATP合成酶活性；采用iTRAQ标记的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行线粒体蛋白质组学分析；借助气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF/MS）进行初级代谢组学分析；运用shRNA基因敲低技术验证关键蛋白（如PRKCA、MCL1）的功能；通过分子对接（SwissDock）预测化合物与ATP合成酶的相互作用位点；并在MDA-MB-231细胞异种移植瘤小鼠模型上通过免疫组织化学（IHC）染色验证靶点蛋白在体内的表达变化。
DET和DETD-35诱导TNBC细胞线粒体功能障碍
研究结果显示，DET和DETD-35能快速（1小时内）升高TNBC细胞中线粒体超氧化物水平，此效应可被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）逆转。处理4小时后，胞质和线粒体中的超氧化物歧化酶SOD1和SOD2的基因表达显著上调。同时，两种化合物处理4小时能诱导mPTP开放，并导致细胞内ATP水平显著下降，这些效应同样可被NAC预处理所逆转。Seahorse分析进一步证实，DET和DETD-35处理能显著降低TNBC细胞的基底呼吸、最大呼吸和ATP产量，并增加质子漏，表明线粒体生物能量代谢稳态被破坏。值得注意的是，这两种化合物对正常乳腺上皮细胞MCF-10A的线粒体呼吸功能没有明显影响，提示其对癌细胞的毒性具有选择性。
线粒体蛋白质组学揭示化合物影响OXPHOS等相关通路
通过对纯化的线粒体组分进行蛋白质组学分析，研究人员鉴定出大量DET或DETD-35处理后的差异表达蛋白（DEPs）。生物信息学分析（DAVID和IPA）表明，这些DEPs显著富集在与“ATP酶活性”、“细胞 catabolic 过程”、“细胞死亡调控”相关的功能中。重要的 canonical pathways 包括“氧化磷酸化”、“糖酵解/糖异生”、“凋亡信号”等。特别值得注意的是，电子传递链（ETC）复合物V（即ATP合成酶）的相关蛋白，如ATP5F1C（ATP5C1）和ATP5MC2（ATP5G2），在化合物处理后表达下调。毒性列表分析也提示“线粒体功能障碍”、“线粒体去极化”与化合物作用密切相关。
PRKCA基因在介导化合物抗TNBC效应中的作用
在众多DEPs中，蛋白激酶Cα（PRKCA/PKCα）的上调引起了研究人员的注意。通过shRNA敲低PRKCA基因，发现敲低细胞对DET和DETD-35诱导的细胞毒性、凋亡以及线粒体生物能量代谢紊乱（如质子漏增加）的敏感性降低，表明PRKCA在介导化合物的抗TNBC效应中扮演重要角色。相比之下，虽然凋亡相关蛋白MCL1也被上调，但其敲低仅对DET诱导的凋亡和质子漏有轻微影响，对DETD-35的作用影响不大，提示MCL1可能不是主要的共同作用靶点。
化合物重编程TNBC细胞初级代谢并揭示与蛋白质组的关联
代谢组学分析显示，DET和DETD-35处理能显著改变TNBC细胞的初级代谢谱。差异表达代谢物（DEMs）涉及多种代谢通路，如心磷脂（CL）生物合成、磷脂酰乙醇胺（PE）生物合成、脂肪酸（FA）生物合成、嘌呤代谢、甲硫氨酸代谢等。在PRKCA敲低细胞中，化合物引起的多种代谢物（如甘油-3-磷酸G3P、磷酸乙醇胺PEtn、己酸HA等）水平变化被逆转或减弱，进一步证实PRKCA参与了化合物诱导的代谢重编程。
蛋白质组与代谢组的整合分析揭示关键网络
皮尔逊相关性分析和IPA网络分析将差异表达的蛋白质和代谢物联系起来，构建了与化合物效应高度相关的网络。这些网络功能高度集中于“ATP合成”、“能量稳态”、“线粒体呼吸”、“线粒体去极化”和“线粒体跨膜电位”等过程。例如，ATP合成酶亚基（ATP5MC2, ATP5F1C）与磷酸、棕榈酸等代谢物在OXPHOS和线粒体功能障碍网络中显著相关。
DET和DETD-35直接抑制ATP合成酶活性
基于上述发现，研究人员推测并验证了两种化合物对ATP合成酶活性的直接抑制作用。体外酶活实验表明，DET和DETD-35处理能显著降低TNBC细胞线粒体中ATP合成酶的活性。在MDA-MB-231异种移植瘤模型中，化合物治疗也显著降低了肿瘤组织内ATP合成酶亚基ATP5A1和ATP5C1的蛋白表达水平。分子对接模拟预测，DET和DETD-35可能分别结合在ATP合成酶的α/β亚基界面和c/a亚基界面，其结合模式与已知的ATP合成酶抑制剂（如aurovertin B, oligomycin）有相似之处，这为它们作为新型ATP酶抑制剂提供了结构基础。
本研究通过多组学整合策略，系统阐明了植物倍半萜内酯DET及其衍生物DETD-35抗TNBC活性的新颖机制。核心结论在于：DET和DETD-35是新型的ATP合成酶抑制剂，它们通过诱导线粒体氧化应激（增加超氧化物、上调SOD1/SOD2）、促进mPTP开放、直接抑制ATP合成酶活性，从而导致细胞内ATP耗竭、破坏线粒体生物能量代谢稳态（降低OCR、影响呼吸链功能），并重编程细胞的初级代谢网络。此外，蛋白激酶Cα（PRKCA）被证实是介导上述部分效应（尤其是代谢重编程和部分线粒体功能紊乱）的关键分子。该研究不仅深化了对DET和DETD-35抗癌作用机制的理解，更重要的是，它将线粒体ATP合成酶确立为对抗TNBC的一个有前景的靶点，为开发基于天然产物的靶向线粒体代谢的癌症治疗策略提供了重要的理论依据和实验证据。
