《Cancer Cell》：Ubiquitination-directed cytosolic DNA degradation governs cGAS-STING-mediated immune response to DNA damage
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本研究针对放疗联合免疫检查点阻断疗法临床响应率低的难题，揭示了SPOP突变和USP7过表达通过上调TREX1促进胞质DNA降解、抑制cGAS-STING通路激活的新机制。研究人员发现USP7抑制剂可逆转免疫抑制状态，增强放疗诱导的抗肿瘤免疫，为克服肿瘤免疫治疗耐药提供了新策略。
免疫治疗虽然改变了多种恶性肿瘤的治疗格局，但其疗效仍局限于部分患者。在前列腺癌这一全球男性第二高发癌症中，仅有不到5%的患者能从免疫检查点阻断（ICB）治疗中获益。这种低响应率促使人们探索旨在提高免疫治疗疗效的联合治疗策略，其中放疗作为一种有前景的辅助手段备受关注。
放疗诱导的DNA损伤可触发免疫原性细胞死亡和胞质DNA释放。这些DNA被cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）识别后，激活STING（stimulator of interferon genes）通路并启动I型干扰素信号。新兴证据表明，肿瘤细胞内在的cGAS-STING活性调控着肿瘤免疫原性，并调节ICB治疗的疗效。重新激活该通路的策略，如STING激动剂或MPS1抑制，已显示出克服ICB耐药性的潜力，强化了放疗与免疫治疗联合的机制基础。
然而，涉及这种联合治疗的临床试验在前列腺癌和其他癌症中取得的成功有限，凸显了机制见解与临床结果之间的脱节。这种差异强调需要更好地理解影响DNA损伤-免疫反应轴的分子通路。
这一相互作用的核心是TREX1（three prime repair exonuclease 1），一种与内质网相关的3'→5'核酸外切酶，通过降解胞质DNA来防止cGAS-STING激活和自身免疫。重要的是，TREX1在癌细胞中适应性上调，以抑制cGAS依赖性胞质DNA感知，从而促进免疫逃逸。靶向TREX1已成为增强肿瘤免疫原性和克服ICB耐药性的有前景策略。然而，驱动其失调的机制仍不清楚，抑制TREX1的治疗方法仍处于早期阶段。
类似DNA损伤，缺陷的DNA修复也通过cGAS-STING通路塑造肿瘤-免疫相互作用。例如，约50%的DNA错配修复缺陷（dMMR）癌症患者对免疫治疗达到客观缓解，这部分归因于肿瘤细胞中胞质DNA积累诱导的cGAS-STING激活。相反，同源重组（HR）作为修复DNA双链断裂的高保真通路，维持基因组完整性。HR缺陷促进基因组不稳定性并提高肿瘤突变负荷（TMB），后者是与免疫反应相关的生物标志物。然而，TMB对免疫治疗疗效的预测价值在某些癌症中不一致，凸显了DNA修复-免疫动态的复杂性。
研究人员此前报道，SPOP（speckle-type POZ protein）突变在前列腺腺癌（PRAD）和子宫体子宫内膜癌（UCEC）中频繁发生，且与TMB增加相关。然而，本研究观察到SPOP突变却与免疫细胞浸润减少相关。这一意外发现促使进一步研究其潜在机制。
研究人员利用TCGA泛癌数据集和TIMER2免疫浸润数据发现，大多数HR基因突变患者显示TMB增加和免疫浸润增强。然而，SPOP突变独特地导致免疫浸润减少，尽管TMB增加。在个体癌症类型中的分析证实，虽然SPOP突变增加TMB或新抗原数量，但并未像在PRAD和UCEC的SPOP野生型（WT）患者中观察到的那样增强CD4+或CD8+T细胞浸润。对100个原发性前列腺肿瘤的进一步分析显示，SPOP突变肿瘤中DNA损伤标志物γ-H2AX表达增加，但CD8+T细胞浸润水平降低。这一矛盾发现表明SPOP突变可作为研究DNA损伤与免疫反应联系的理想模型。
DNA损伤后从细胞核泄漏到细胞质的双链DNA（dsDNA）是免疫激活的关键触发因素。研究人员发现，最常见的SPOP突变F133V抑制了电离辐射（IR）诱导的胞质dsDNA积累。SPOP突变或敲除加速了DNA损伤后胞质dsDNA的衰减，特别是长度超过20bp的dsDNA片段。这些结果表明SPOP突变的前列腺癌细胞减少DNA损伤后胞质dsDNA积累，表明这些突变逃避免疫激活的潜在机制。
通过cGAS-STING通路的胞质dsDNA感知在先天免疫中起关键作用。研究发现，在PC-3和C4-2对照细胞中，IR触发cGAS-STING通路激活，表现为磷酸化STING（p-STING）和IRF3（p-IRF3）水平增加、I型干扰素反应基因（如IFNB1、IFIT1和CXCL10）表达增强以及cGAMP水平升高。然而，SPOP突变或敲除细胞未能展现这些反应。类似地，IR诱导的cGAS胞质分布和微核形成在SPOP突变和敲除细胞中被废除。这些发现在临床相关环境中得到验证，使用来自携带SPOP WT或F133L突变的前列腺癌病变的患者来源异种移植（PDX）模型。IR治疗未改变SPOP WT或SPOP突变PDX肿瘤的新抗原数量。IR治疗后，SPOP F133L突变PDX肿瘤未显示p-IRF3水平增加，而SPOP WT PDX肿瘤则显示增加。此外，IR诱导SPOP WT肿瘤中干扰素刺激基因（ISGs）表达，但未诱导F133L突变肿瘤中的表达。对患者队列中前列腺肿瘤组织的分析进一步支持这些发现，显示SPOP突变肿瘤中磷酸化IRF3水平相对较低。对TCGA前列腺癌或子宫癌数据集的分析进一步支持这些发现，显示SPOP WT和突变肿瘤之间的干扰素反应无差异。这些结果证明SPOP突变损害响应DNA损伤的cGAS-STING介导的免疫激活。
为探索SPOP突变如何影响胞质dsDNA积累，研究人员检查了SPOP与各种已知核酸外切酶的相互作用。有趣的是，发现SPOP特异性与TREX1相互作用，而不与其他核酸外切酶相互作用。值得注意的是，IR治疗后短时间内，SPOP突变的PC-3和C4-2细胞中TREX1蛋白水平持续升高。进一步分析显示，异位SPOP表达以剂量依赖性方式降低TREX1蛋白水平，这一效应可被蛋白酶体抑制剂MG132完全消除。相反，SPOP敲除增加内源性TREX1蛋白水平而不影响TREX1 mRNA。此外，重新引入SPOP恢复TREX1降解并增强IR后胞质dsDNA积累和I型干扰素反应。这些发现表明TREX1是SPOP的泛素化靶标。支持这一点的是，SPOP促进TREX1多聚泛素化，减少其半衰期，而SPOP缺失产生相反效应，所有这些均可通过SPOP重新引入来挽救。为排除其他SPOP底物如BRD4的潜在影响，用BRD4抑制剂JQ1处理PC-3和C4-2细胞。值得注意的是，JQ1处理对TREX1蛋白水平或DNA损伤后cGAS激活无影响。被SPOP靶向的蛋白通常包含一个共识SPOP结合基序（SBC：[AVP]·[ST][ST][ST]）。TREX1在其C端片段（247AVTTT251）包含一个推定的SBC基序。删除这五个氨基酸完全破坏SPOP与TREX1相互作用、泛素化和降解的能力，确认247AVTTT251为TREX1中的功能性SBC基序。此外，虽然TREX1缺失增加IR治疗后cGAS-STING激活（升高p-STING和p-IRF3）、胞质dsDNA积累和I型干扰素反应，但重新表达TREX1△SBC比TREX1 WT更强地逆转这些效应。总之，这些发现将TREX1鉴定为SPOP的新底物，证明SPOP通过TREX1泛素化和降解调控胞质dsDNA积累。
在前列腺癌中，SPOP突变主要发现于对其底物结合至关重要的MATH结构域。使用免疫共沉淀（co-IP）分析，观察到SPOP△MATH突变体失去与TREX1结合的能力。相反，缺乏CUL3结合且无法泛素化底物的△BTB突变体保持与TREX1结合但未能促进其泛素化。此外，产生四个前列腺癌相关SPOP突变体和四个子宫体子宫内膜癌相关SPOP突变体。Co-IP分析显示，所有这些突变体与WT SPOP相比表现出与TREX1结合受损。这些突变也显著减少SPOP介导的TREX1泛素化并延长其在293T细胞中的半衰期。此外，虽然TREX1敲低导致IR治疗后胞质dsDNA积累增加和干扰素反应，但在PC-3细胞中表达WT或突变SPOP不影响胞质dsDNA水平或干扰素反应。为研究这些发现的临床相关性，评估患者标本中的TREX1蛋白水平，发现75%的SPOP突变肿瘤显示强TREX1染色。相反，仅20%的SPOP-WT肿瘤显示强染色，50%显示中等染色。这些结果表明SPOP中的病理生理突变破坏其降解TREX1和调控DNA损伤后胞质dsDNA积累的能力。
尽管观察到SPOP突变肿瘤具有升高的TREX1蛋白水平，但一些SPOP WT肿瘤中的总TREX1蛋白水平仍然较高。这表明其他机制，如去泛素化酶，可能调控TREX1表达。为研究这一点，用12种商业可用的针对15种去泛素化酶的抑制剂处理PC-3细胞，发现只有USP7抑制剂XL177A降低TREX1蛋白水平。RNA-seq分析显示，XL177A处理特异性增加干扰素γ和α反应， among other deubiquitinase inhibitors。此外，XL177A以剂量依赖性方式降低TREX1蛋白水平而不影响TREX1 mRNA水平。这种降低可被蛋白酶体抑制剂MG132在PC-3、C4-2和RM1细胞中逆转，表明XL177A通过蛋白酶体降解降低TREX1丰度。确实，USP7抑制通过XL177A和另外两种商业可用的USP7抑制剂FT671和GNE-6776，增加TREX1泛素化水平并缩短内源性TREX1蛋白在PC-3和C4-2细胞中的半衰期。USP7可能作为负责调控TREX1稳定性的去泛素化酶。支持这一点的是，发现内源性USP7与TREX1在PC-3前列腺癌细胞中相互作用。值得注意的是，WT而非催化失活USP7（C223A）的表达诱导TREX1多聚泛素化减少和蛋白半衰期增加。此外，虽然SPOP在体外泛素化条件下催化TREX1的多聚泛素化，但USP7的同时存在显著抑制TREX1多聚泛素化。一致地，USP7敲低增加TREX1泛素化并缩短其蛋白半衰期，模拟XL177A处理的效果。对患者标本中USP7水平的进一步分析显示USP7与TREX1表达呈正相关。在TCGA泛癌数据集中，多变量分析显示USP7表达是PRAD队列中免疫浸润的独立预测因子，并且也在其他几种癌症类型中独立与CD8+T细胞浸润相关。总之，这些结果将USP7鉴定为真正的去泛素化酶，抑制TREX1蛋白泛素化，从而维持癌细胞中TREX1稳定性。
与USP7调控TREX1去泛素化和稳定的发现一致，USP7敲低导致IR处理后PC-3细胞中胞质dsDNA水平增加。类似SPOP突变的效果，USP7敲低也抑制DNA损伤后胞质dsDNA的衰减。此外，观察到USP7敲低PC-3细胞和RM1细胞在IR处理后STING和IRF3磷酸化增加。一致地，cGAMP水平和IFNB1表达在USP7敲低后升高，伴随微核形成增加和cGAS激活增强。接下来检查USP7抑制在SPOP突变前列腺癌细胞中的效果。有趣的是，虽然SPOP突变单独未触发DNA损伤后胞质dsDNA积累或cGAS-STING激活，但USP7抑制剂XL177A处理成功逆转这一点，并在SPOP WT或F133V突变表达的PC-3和C4-2细胞中恢复胞质dsDNA积累和cGAS-STING激活。类似XL177A处理，FT671和GNE-6776也成功激活PC-3和C4-2细胞在IR治疗后的cGAS-STING通路。这些结果表明USP7抑制增加DNA损伤后胞质dsDNA积累和cGAS激活，无论前列腺癌中SPOP状态如何。
这些结果表明USP7介导的免疫抑制在临床环境中相关。为评估这一点，研究人员通过比较放化疗前和后收集的患者样本来检查USP7介导的免疫抑制的临床相关性。由于从初始前列腺癌队列获取治疗后样本的技术挑战，转而分析来自42名接受放化疗和免疫治疗联合治疗的晚期宫颈癌患者的标本。首先在SiHa和C-33A宫颈癌细胞系中确认SPOP、USP7和TREX1之间的调控关系与前列腺癌中的发现一致。将放化疗前和后获得的连续宫颈活检处理成组织微阵列，同时收集配对血清样本进行肿瘤标志物分析。多重免疫组织化学（mIHC）分析显示USP7和TREX1蛋白水平之间呈正相关。值得注意的是，放化疗诱导的cGAS-STING激活和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）——包括IRF3磷酸化和CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群——在低USP7表达的肿瘤中观察到。相反，过表达USP7的肿瘤显示IRF3磷酸化和TIL浸润显著抑制。血清学分析证明USP7表达与治疗反应呈负相关，通过治疗后鳞状细胞癌抗原（SCC）、癌胚抗原（CEA）和癌抗原125（CA125）水平证明。临床上，升高的USP7表达预测两年内疾病加速进展。这些发现共同将USP7鉴定为放化疗抵抗的预后生物标志物和增强治疗疗效的潜在治疗靶点。一致地，低USP7表达与来自MD Anderson的食管癌样本中CD8A表达增加相关。然而，在STING缺陷的SW48和cGAS缺陷的A375细胞中，USP7敲低未能激活IR治疗后的cGAS-STING通路，强调USP7介导的免疫抑制依赖于完整的cGAS-STING信号轴。
基于USP7通过胞质dsDNA积累和cGAS-STING激活损害癌症免疫的发现，研究人员假设USP7抑制可与放疗和免疫治疗协同。为测试这一点，治疗携带RM1肿瘤的同基因小鼠，无论Usp7 WT或Usp7敲低，有或无放疗和免疫治疗联合。结果显示，IR和抗CTLA4抗体联合产生10只小鼠中3只存活。然而，额外的Usp7敲低减缓肿瘤生长并将存活率提高到10只小鼠中6只。进一步分析显示，Usp7敲低显著降低TREX1蛋白水平，升高IRF3磷酸化，并增强TILs，包括CD3+、CD4+和CD8+T细胞，在联合治疗组中。在用USP7抑制剂XL177A治疗的RM1荷瘤小鼠中获得类似结果。此外，将TREX1构建体重新引入Trex1敲除RM1细胞证明，与TREX1 WT相比，携带TREX1△SBC突变体的小鼠在XL177A加放化疗后显示加速肿瘤生长和降低存活率。一致地，TREX1△SBC比TREX1 WT更有效抑制IR诱导的cGAS-STING激活和TILs，确认TREX1作为SPOP下游效应器的作用。为进一步模拟晚期人类前列腺癌，建立Pten/Rb1双敲除（Pten/Rb1 DK）小鼠前列腺癌细胞系（C57BL/6背景），其重现低分化肿瘤并代表免疫学"冷"环境。一致地，使用GNE-6776的USP7抑制也减少肿瘤生长并延长Pten/Rb1 DK荷瘤小鼠当与放化疗联合时的存活。进一步在C57BL/6J小鼠中进行安全性评估，用比疗效研究中使用的剂量高3倍的XL177A治疗。苏木精和伊红（H&E）染色显示主要器官（心、肝、脾、肺、肾）在各治疗组中无显著组织损伤。一致地，血清生化分析证明，虽然免疫相关炎性细胞因子轻微增加，但肝肾功能保持在正常范围内。总之，这些发现表明USP7抑制增强放疗和免疫治疗的疗效。
研究人员主要从前列腺癌、子宫体子宫内膜癌和宫颈癌模型得出发现。因此，建议USP7抑制以增强放疗和ICB疗效的初始临床探索应优先考虑这些肿瘤类型。由于从前列腺癌患者获取匹配的放化疗前和后样本的技术限制，使用配对的宫颈癌活检作为支持治疗后USP7介导的免疫抑制的临床证据。与发现和先前研究一致，TREX1抑制在cGAS或STING缺陷的肿瘤细胞中效果最小。因此，完整cGAS-STING通路的存在对于肿瘤响应USP7或TREX1抑制至关重要。希望这些结果将鼓励更广泛研究USP7-TREX1轴作为治疗靶点及其在更广泛恶性肿瘤中提高放疗-ICB疗效的潜力。
关键技术方法
本研究综合利用生物信息学分析（TCGA、TIMER2）、分子生物学技术（免疫印迹、免疫共沉淀、泛素化分析）、细胞模型（基因敲除/敲低、突变体构建）、动物模型（同基因小鼠、PDX模型）以及临床样本分析（组织微阵列、多重免疫组化）。特别值得注意的是，研究团队建立了来自前列腺癌患者的PDX模型，并收集了42例晚期宫颈癌患者放化疗联合免疫治疗前后的配对样本进行转化医学研究。这些多层次的研究方法为机制验证和临床相关性提供了坚实证据。
研究结果
SPOP突变减少DNA损伤后胞质dsDNA积累
通过TCGA泛癌数据集分析发现SPOP突变与免疫浸润减少相关。在前列腺癌患者样本中，SPOP突变肿瘤显示DNA损伤增加但CD8+T细胞浸润降低。细胞实验证实SPOP突变或敲除抑制IR诱导的胞质dsDNA积累，加速胞质dsDNA衰减。
SPOP突变损害cGAS-STING介导的免疫激活
SPOP突变或敲除细胞在IR处理后未能激活cGAS-STING通路，表现为p-STING、p-IRF3水平不增加，干扰素反应基因表达不升高。PDX模型和患者样本分析进一步验证SPOP突变抑制cGAS-STING通路激活。
SPOP通过泛素化降解TREX1
SPOP与TREX1直接相互作用，促进其泛素化降解。SPOP突变破坏与TREX1结合，导致TREX1蛋白稳定性增加。TREX1的SBC基序（247AVTTT251）介导与SPOP相互作用，该基序突变体（△SBC）抵抗SPOP介导的降解。
USP7稳定TREX1蛋白
USP7抑制剂特异性降低TREX1蛋白水平。USP7与TREX1相互作用，去除其泛素化修饰，延长半衰期。临床样本显示USP7与TREX1表达正相关，且USP7高表达与CD8+T细胞浸润负相关。
USP7抑制增强cGAS-STING激活
USP7敲低或抑制剂处理增加IR后胞质dsDNA积累、cGAMP水平和干扰素反应。在SPOP突变背景下，USP7抑制可恢复cGAS-STING通路激活。
USP7表达预测放化疗疗效
宫颈癌患者分析显示，USP7高表达与放化疗后IRF3磷酸化抑制、TIL浸润减少、肿瘤标志物水平升高以及疾病快速进展相关。
靶向USP7增强放化疗疗效
动物实验证明USP7敲低或抑制剂联合放疗和抗CTLA4治疗显著抑制肿瘤生长、提高生存率，并增强TIL浸润。安全性评估显示USP7抑制剂在有效剂量下无明显毒性。
研究结论与意义
本研究揭示了泛素化调控的胞质DNA降解在决定cGAS-STING介导的DNA损伤免疫应答中的核心作用。具体而言，发现E3泛素连接酶SPOP促进TREX1降解，而去泛素化酶USP7稳定TREX1，从而形成调控胞质DNA水平的关键分子开关。SPOP突变或USP7过表达通过上调TREX1促进胞质DNA降解，抑制cGAS-STING通路激活，导致肿瘤免疫逃逸。
这些发现提供了几个重要启示：首先，阐明了SPOP突变肿瘤中TMB增加与免疫浸润减少这一矛盾现象的机制基础，解决了DNA损伤与免疫激活之间联系的关键知识空白。其次，鉴定USP7作为TREX1的关键调控因子，为靶向TREX1提供新的治疗策略。第三，临床数据表明USP7表达可作为预测放化疗疗效的生物标志物，具有重要临床转化价值。最后，临床前研究证明USP7抑制剂与放疗和免疫治疗联合的协同抗肿瘤效果，为克服当前肿瘤免疫治疗耐药性提供新途径。
该研究不仅深化了对DNA损伤-免疫应答轴的理解，而且提出了通过靶向USP7-TREX1轴增强放化疗疗效的具体策略，为改善癌症患者预后提供新的治疗思路。
