《Carbon Capture Science & Technology》：A rapid, high-throughput assay for the detection of O-GlcNAcylation
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定量点印法（QDB）用于复杂生物样本中蛋白O-糖基化的高通量灵敏检测，检测限2.5μg，线性相关系数达0.99，在细胞和糖尿病小鼠组织中验证与WB一致性，可扩展至其他翻译后修饰检测。
杨晓宇|张环环|杨春华|白亚芳|杨占毅|贾米|朱彦平
中国山东省烟台市滨州医学院分子靶向与智能诊断治疗技术创新中心，邮编264003
摘要
O-糖基化（O-GlcNAcylation）水平是细胞代谢状态的关键指标。然而，由于O-糖基化的丰度低且性质不稳定，对其进行高通量定量分析仍面临巨大挑战。在这项研究中，我们开发了一种基于定量点印迹（Quantitative Dot Blot, QDB）的技术，用于检测复杂生物样本中蛋白质的O-糖基化程度。该技术对O-糖基化蛋白的检测具有高灵敏度，在总蛋白浓度为2.5至20μg的范围内表现出线性响应，决定系数（R2）为0.99，检测限为2.5μg。此外，该技术在TMG处理的HEK293T细胞中定量不同O-糖基化水平时表现出稳健的性能，线性回归R2为0.9353。我们进一步验证了该技术在糖尿病小鼠组织（包括比目鱼肌和视网膜）中的适用性。QDB检测到的O-糖基化变化趋势与Western blot（WB）的结果一致。综上所述，QDB技术可应用于多种组织类型的O-糖基化水平测定，有望成为临床诊断中评估O-糖基化活性及抑制效应的有效工具。同时，该平台也有潜力扩展到其他翻译后修饰的检测与监测。
引言
O-糖基化是一种蛋白质翻译后修饰（PTM），其特征是O-连接的N-乙酰葡糖胺基团附着在底物蛋白的丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基上[1][2][3]。这种修饰普遍存在于细胞核、细胞质和线粒体等多个亚细胞结构中[4]。细胞内O-糖基化水平的动态平衡由一对独特的酶维持：O-连接的β-N-乙酰葡糖胺转移酶（OGT）和O-糖基化酶（OGA），它们分别负责O-连接N-乙酰葡糖胺的添加和去除[5][6]。作为应激和营养传感器，O-糖基化对细胞存活至关重要，并在细胞周期调控、凋亡和信号转导等多个细胞过程中发挥关键作用[7]。多种疾病都与异常的O-糖基化水平相关，涉及代谢性疾病、癌症等多种类型[8][9][10][11][12][13][14]。然而，在细胞和组织裂解物等复杂生物样本中可靠地实现O-糖基化水平的高通量定量仍是一个重大挑战。目前市场上尚无商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒用于O-糖基化的检测，Western blot（WB）是主要的定量方法。O-糖基化水平的定量通常基于免疫反应条带的强度进行半定量分析。WB的优势在于其特异性，因为它依赖于抗体-抗原结合反应，且商业化的单克隆抗体已被证明有效。但由于技术限制，WB不适用于高通量分析，其准确性高度依赖于图像分析方法[12]。除了WB之外，还开发了基于代谢标记或化学修饰的替代方法。代谢标记方法通常受特异性不足的制约，而使用半乳糖转移酶对O-糖基化基团进行酶促标记的方法具有较高特异性[15]，但其他化学修饰策略在特异性方面仍面临挑战，限制了其广泛应用[9][10][12][13][16][17]。基于质谱的方法可能克服这些限制，但需要昂贵的仪器和专业的技术支持[17]。因此，一种可靠、快速且适用于常规实验室的高通量O-糖基化检测方法仍然缺乏，亟需开发。
定量点印迹（Quantitative Dot Blot, QDB）是一种类似ELISA的平台，适用于蛋白质表达的高通量定量分析[18][19][20][21]。该方法中，样本裂解物与针对目标蛋白的一抗在特制的反应孔中孵育，通过电化学发光直接输出信号，无需额外的图像定量步骤。与WB相比，QDB方法省略了SDS-PAGE和膜转移等耗时步骤，实现了更快的定量和更高的灵敏度及线性[18][19]。该平台已成功应用于检测细胞裂解物、动物组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本中的蛋白质水平[22]。其核心优势在于能够实现高通量定量。利用该方法，我们在800多个FFPE人类乳腺癌样本中定量了三种不同的生物标志物[22][23]。这些特点使QDB平台成为临床诊断和机制研究中评估翻译后修饰水平的强大工具。
在本研究中，我们基于QDB平台开发了一种新的检测方法，用于定量复杂生物样本中的O-糖基化水平。系统比较了QDB方法与使用相同抗体的WB方法的线性和灵敏度，并在细胞水平上验证了其稳健性。随后在组织水平上也验证了该方法的可靠性和快速性。最后，我们的研究证明了QDB平台在O-糖基化以外的翻译后修饰定量分析中的适用性。
试剂信息
通用试剂
用于检测O-糖基化的 primary antibody 从 Abcam（RL-2, #82332, 英国剑桥）购买；针对 β-微管蛋白的抗体从 Sion Biological（M20005, 中国北京）购买；山羊抗小鼠 secondary antibody 从 Jackson ImmunoResearch（115-005-003, 美国）购买；QDB 板由 Yantai Zestern Biotechnique（中国烟台）生产；Bradford Dye Reagent 蛋白质测定试剂盒来自 TaKaRa（日本）；Thiamet-G（TMG）从……购买结果与讨论
QDB 已被确立为一种通用的 O-糖基化定量平台，图 1 展示了其分析流程示意图。从细胞或组织中提取的样本直接施加到 QDB 板底部的膜上，随后进行抗体-抗原结合反应。最后，使用微孔板读数仪测量目标蛋白的定量值。
结论
总之，我们开发了一种基于抗原-抗体反应的可靠且灵敏的免疫印迹方法（QDB），用于检测蛋白质的 O-糖基化修饰。该方法克服了传统 WB 的局限性，如多步骤操作、耗时和低通量（表 1）。此外，QDB 的检测限和灵敏度均已得到充分验证，检测限较低
作者贡献声明
杨占毅：方法学设计、实验实施。
白亚芳：数据可视化、方法验证、实验实施。
朱彦平：文章撰写与编辑、初稿撰写、指导、概念构思。
贾米：文章撰写与编辑、初稿撰写、资金筹集、概念构思。
杨晓宇：文章撰写与编辑、数据可视化、方法验证、项目管理。
杨春华：文章撰写与编辑、方法验证、指导、资金筹集。
张环环：利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
资助
本研究得到了
国家自然科学基金（项目编号：32170989）和
山东省自然科学基金（项目编号：ZR2021MH141）的资助。
致谢
作者感谢 Yantai Zestern Biotechnology Co., Ltd. 提供的 QDB 板。
