《The Crop Journal》：OsMAP4K6 positively regulates salt tolerance via activating OsMKK6 in rice
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本研究揭示了水稻MAPK级联通路中上游激酶OsMAP4K6通过直接磷酸化OsMKK6第13位丝氨酸（Ser13），激活下游信号通路，进而调控离子稳态增强耐盐性的新机制。该发现为作物抗逆育种提供了新靶点。
随着全球气候变化加剧，土壤盐渍化已成为制约农业生产的重要环境胁迫因素。据统计，全球约三分之一耕地受到盐胁迫影响，导致作物减产高达50%-70%。水稻作为全球过半人口的主粮，其对盐胁迫高度敏感，因此解析水稻耐盐分子机制对保障粮食安全具有重要意义。尽管已有研究表明促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联通路在植物逆境响应中起核心作用，但位于该通路最上游的MAP4K家族成员在作物耐盐性中的功能仍知之甚少。
南京农业大学研究团队在《The Crop Journal》发表的研究，首次系统揭示了水稻MAP4K家族成员OsMAP4K6通过直接磷酸化OsMKK6关键位点正向调控耐盐性的新机制。研究人员通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了OsMAP4K6敲除突变体，利用农杆菌介导的遗传转化获得过表达株系，结合生理表型分析、非损伤微测技术（NMT）、免疫共沉淀-质谱联用（IP-MS）、体外磷酸化 assay 及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等关键技术，阐明了OsMAP4K6-OsMKK6信号模块的工作模型。
3.1 OsMAP4K6是水稻中保守的功能性激酶
系统发育分析显示OsMAP4K6与拟南芥AtMAP4K4亲缘关系最近，其激酶结构域包含典型的GxGxxG/A模体、ATP结合位点Lys43（K43）及DFG激活片段。体外实验证实OsMAP4K6具有自磷酸化活性，亚细胞定位显示其定位于细胞质和细胞膜。盐胁迫可诱导OsMAP4K6转录表达上调3.3倍，并激活其激酶活性。
3.2 OsMAP4K6正向调控水稻耐盐性
表型分析发现，过表达株系在120 mmol/L NaCl处理下存活率提高、丙二醛（MDA）含量和电解质渗漏降低，而敲除突变体表现为盐敏感。离子含量测定显示过表达株系能维持更低的Na+含量和更高的K+含量，NMT检测证实其通过增强根尖Na+外排并抑制K+外流维持离子稳态。
3.3 OsMAP4K6通过增强Na+外排和促进K+吸收提高耐盐性
ICP-OES分析表明过表达株系在盐胁迫下根和地上部Na+积累量显著低于野生型，K+保留能力更强。离子流动力学检测进一步揭示OsMAP4K6通过调控质膜离子通道活性优化Na+/K+平衡。
3.4 OsMAP4K6与OsMKK6发生物理相互作用
通过GST pull-down、Co-IP和荧光互补成像（LCI）实验，证实OsMAP4K6与OsMKK6在体内外直接相互作用，且互作区域位于两者的N端结构域。盐胁迫可增强二者结合强度。
3.5 OsMAP4K6通过磷酸化OsMKK6的Ser13位点激活其活性
LC-MS/MS鉴定发现OsMAP4K6特异性磷酸化OsMKK6第13位丝氨酸。构建磷酸化缺陷型（S13A）和磷酸化模拟型（S13D）突变体进行激酶实验，证明Ser13磷酸化是盐胁迫下激活OsMKK6的必要条件。免疫沉淀激酶实验显示OsMAP4K6缺失会显著抑制盐诱导的OsMKK6激活。
3.6 OsMKK6与OsMAP4K6具有相似的耐盐功能
OsMKK6过表达株系表现出与OsMAP4K6类似的耐盐增强表型，其调控离子稳态的作用模式高度一致，证实二者在同一信号通路中协同工作。
该研究首次在植物中建立了MAP4K-MAPK级联的直接调控关系，揭示了OsMAP4K6-OsMKK6模块通过磷酸化修饰精确调控离子转运的新途径。与已知的MPK6-SOS1“执行单元”不同，该模块位于信号通路更上游，扮演“协调枢纽”角色，为理解植物逆境信号网络整合机制提供了新视角。研究为水稻耐盐分子育种提供了双靶点（OsMAP4K6/OsMKK6）策略，对应对全球盐渍化挑战具有重要应用价值。
