《ACS Infectious Diseases》：Intravitreal Administration of a Selective HDAC6 Inhibitor Prevents Retinal Damage Progression in the Acute Ocular Toxoplasmosis Model
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本文推荐一篇关于组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）选择性抑制剂Tubastatin A（TST）治疗眼弓形体病（OT）的创新研究。该研究通过体内外实验证实，单次玻璃体腔注射TST即可通过阻断弓形虫（Toxoplasma gondii）入侵、保护视网膜色素上皮（RPE）紧密连接、调节HDAC6-Hsp90通路以降低VEGF和HSF1表达，并调控小胶质细胞/巨胶质细胞活化及关键细胞因子（如IL-12、IL-4、IL-17A）分泌，从而在急性OT模型中有效阻止视网膜损伤进展，为OT的靶向治疗提供了新策略。
TST保护视网膜色素上皮的紧密连接和粘附连接
为了确认TST是否在弓形虫感染期间保护RPE的完整性，研究使用ARPE-19细胞单层感染速殖子并用5 μM TST处理1或2小时。免疫荧光显微镜和蛋白质印迹分析显示，感染导致闭锁小带蛋白1（ZO-1）染色减少40%，而TST处理阻止了这种减少。然而，蛋白质印迹分析显示各组间ZO-1表达水平无显著差异，表明ZO-1的调节可能与其定位有关，而非表达水平。对于粘附连接，感染2小时后，钙黏蛋白（pan-cadherin）表达减少40%。在感染并TST处理2小时的组别中，TST阻止了感染引起的粘附连接表达下降。这些发现表明TST可预防感染诱导的紧密连接和粘附连接减少，从而有助于维持RPE完整性。细胞活力实验（MTS法）显示，TST在高达332 μM的浓度下对ARPE-19细胞未产生显著毒性。
速殖子的体外入侵在TST处理后受阻
为了评估HDAC6抑制剂是否会阻断弓形虫的进入和感染的建立，ARPE-19细胞用5 μM TST预处理48小时，然后与速殖子相互作用1或2小时。免疫荧光显微镜分析显示，未用TST预处理时，寄生虫在1或2小时后成功内化，宿主细胞骨架（肌动蛋白丝和乙酰化微管）在寄生虫空泡（PV）周围的募集明显。相反，TST预处理损害了这些结构的募集和寄生虫的进入。扫描电子显微镜结果也支持TST处理阻止了速殖子主动侵入所需的宿主细胞骨架调节。
TST在体外保护RPE稳态对抗弓形虫感染
为了研究感染对RPE内关键稳态因子的影响，ARPE-19细胞感染速殖子并用5 μM TST处理24小时。mRNA分析显示，弓形虫感染使VEGFA表达增加100倍，HSF1表达增加52倍。TST处理显著降低了VEGFA和HSF1的增加，使其恢复至接近基线水平。然而，THBS-1表达在感染细胞中下降，且TST未能逆转这种下降。HIF-1α的转录在感染后未改变，但TST处理显著下调了其表达。这些发现表明TST可通过调节血管生成因子和热休克蛋白表达来调节对弓形虫感染的应激反应，从而有助于维持RPE稳态。
玻璃体腔注射TST在体内模型中安全
为了评估TST对视网膜组织的潜在毒性，雄性C57BL/6小鼠（8-12周龄）双眼玻璃体腔注射10 μg/μL TST（每眼2 μL）。注射后5天进行组织学分析。与未感染未处理的对照组相比，TST注射眼显示视网膜层结构无变化，确认了TST用于玻璃体腔化疗的安全性。
玻璃体腔注射TST避免了弓形虫向缓殖子阶段的转化
为了研究TST是否可用于OT的药物重定位，小鼠腹腔注射104个ME49-GFP株速殖子建立OT模型。感染后第10天，每眼单次注射10 μg/μL TST（2 μL）。治疗5天后，通过qPCR分析寄生虫载量（B1基因标记），并通过RT-qPCR分析阶段特异性标记SAG1（速殖子）和BAG1（缓殖子）的mRNA表达。分析显示，感染后第10天寄生虫载量最高，第15天未干预组有所下降。TST治疗5天后，寄生虫载量与未治疗组在第15天时相比无变化。关于阶段特异性标记，SAG1水平各组间无显著差异。BAG1水平在感染后第15天组比第10天组增加1.5倍。在治疗组中，BAG1水平比未治疗组降低了3倍。这些发现表明，单次玻璃体腔注射TST在短时间内不足以减少寄生虫载量，但干扰了速殖子向缓殖子的转化。
玻璃体腔注射TST预防了弓形虫感染引起的视网膜损伤
研究调查了TST在预防弓形虫感染引起的视网膜病变进展方面的有效性。组织病理学分析显示，感染后第18天，未治疗的感染小鼠视网膜组织出现显著形态学改变，包括光感受器玫瑰花环形成、内外节（IS/OS）层细胞浸润。而所有接受TST治疗的感染小鼠（16只眼）均显示IS/OS区域和RPE得到保护，视网膜内无浸润细胞。为研究TST在视网膜脉络膜炎早期是否有效，另一感染组在感染后第10天接受单次TST注射，并于第15天处死。组织病理学和透射电镜分析显示，感染小鼠的布鲁赫膜（Bruch's membrane）形态不连续，内、外胶原层出现无定形电子致密碎片。治疗后，同一区域显示整体形态保存完好，RPE与基底膜之间的交错区域维持良好。这些结果表明，TST治疗可在感染早期预防病变开始，或在视网膜脉络膜炎已建立时阻止病变恶化，但并未减少寄生虫载量。
TST在保护视网膜粘附区域中起关键作用
为了理解TST治疗是否涉及ZO-1的调节，感染小鼠在感染后第10天接受治疗，治疗5天后分析视网膜组织。免疫定位显示，未感染对照组小鼠沿细胞膜（外界膜和布鲁赫膜）均有均匀的ZO-1标记。感染后第10天和第15天的小鼠显示标记微弱，呈小点状。治疗5天后，治疗动物显示ZO-1标记明显恢复。对6只眼20个随机视野的荧光强度定量显示，治疗使ZO-1荧光强度恢复到未感染动物的基础水平，表明对外血视网膜屏障的保护作用。
玻璃体腔注射TST调节弓形虫感染引起的微胶质和巨胶质细胞活化
微胶质细胞是视网膜的常驻免疫细胞。免疫荧光显示，弓形虫感染在感染后第10天和第15天诱导了视网膜组织内Iba-1+（离子钙结合适配分子1）的强烈标记。感染后第15天，可观察到Iba-1+细胞在层间迁移及其延长的细胞质突起。未治疗感染小鼠的Iba-1+细胞数量比未感染小鼠增加7倍。TST治疗后，微胶质细胞活化下调，Iba-1+细胞数量比未治疗感染小鼠减少3倍。mRNA和总蛋白定量分析显示，Iba-1表达随着蛋白增加而下降，治疗后mRNA表达恢复至接近基础水平。
巨胶质细胞，如星形胶质细胞和米勒细胞（Müller cells），也参与反应。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是胶质活化的标记。未治疗感染动物显示GFAP标记增加，基因表达也升高。TST治疗调节了胶质活化，防止其增加，基因表达和免疫标记强度与未感染动物相似。谷氨酰胺合成酶（Glut-syn）蛋白分析显示，未治疗感染小鼠的米勒细胞进程形态改变。TST治疗后，通过Glut-syn蛋白染色证实了米勒细胞进程形态分布的恢复。这些发现表明TST调节微胶质和巨胶质细胞活化，从而保护视网膜组织免受弓形虫感染和免疫反应失衡的损害。
TST在眼弓形体病中显示抗炎作用
为了解OT中关键促炎和调节性细胞因子在TST治疗后是否改变，感染小鼠在感染后第10天接受单次玻璃体腔注射，治疗5天后处死。通过mRNA分析评估Tgfβ2、Il12、Il4和Il17a的表达。并通过ELISA检测细胞因子蛋白水平。Tgfβ2、Il12、Il4和Il17a的表达在感染后第10天和第15天显示出均匀的转录反应，即低于未感染动物的基础水平。TST治疗导致基因表达水平部分恢复，但Tnf-α表达下降且治疗后无调节效应。
细胞因子蛋白水平分析显示，弓形虫感染导致IFN-γ在感染后第15天比基线水平增加45%，治疗后降低50%。促炎细胞因子IL-6和IL-12p70水平在感染期间增加。IL-6在感染后第10天和第15天分别增加28%和75%，治疗后比第15天组减少37%。调节性细胞因子IL-17A在感染后第10天和第15天分别增加17%和14%，治疗后其分泌下降，接近未感染小鼠水平。IL-12p70在感染后第10天增加75%，第15天比未感染组减少18.42%。治疗后比未治疗感染组减少26.34%，且比未感染动物基础水平低13%。IL-4水平在感染小鼠中显著增加，感染后第10天和第15天分别增加37%和41%，治疗后比感染第15天减少20%。
这些结果表明TST干扰了对抗弓形虫感染的关键细胞因子（如IFN-γ、IL-12、IL-17）的表达和分泌，从而有助于形成减少炎症反应的负反馈环路。此外，这种抗炎状态可能与TGF-β2表达增加有关。促炎细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-17的调节是TST保护视网膜组织免受过度炎症毒性作用的另一机制。
讨论
玻璃体腔注射抗生素、抗真菌药和抗病毒药治疗眼部感染性疾病因其有效性和安全性日益被采纳。对于对全身性抗叶酸药无反应的急性OT病例，这是一种一致的临床策略。药物重定位策略可能缩短寻找OT新疗法的时间和成本。HDAC6抑制剂TST在体外作为潜在的抗弓形虫候选药物已被评估。
体外实验中，TST即使在262 μM的高浓度下对RPE细胞也无细胞毒性，该浓度是弓形虫速殖子IC50的500倍。体内安全性评估显示，玻璃体腔注射20 μg/2 μL TST在注射后5天未引起任何变化，表明TST对视网膜组织安全。
TST通过阻止肌动蛋白募集用于寄生虫空泡形成，从而阻碍寄生虫入侵。HDAC6抑制有助于增加皮质肌动蛋白细胞骨架的稳定性。TST对细胞连接蛋白的保护作用在体内实验中得到证实。超微结构数据显示感染动物布鲁赫膜改变，RPE微绒毛与基底膜之间的粘附连接畸形。治疗感染小鼠中该屏障得到保护。免疫荧光实验显示治疗恢复了急性OT期间闭锁小带蛋白，这可能解释了所有治疗动物视网膜下区域的保护现象。
先前研究描述了OT中血管生成因子的表达，包括Vegf增加和Thbs1减少。HDAC6-Hsp90轴调节VEGF表达。TST治疗逆转了感染ARPE-19细胞中VEGF水平的增加，但不影响THBS1表达。HIF-1α表达在感染后未改变，但TST处理显著下调了感染ARPE-19细胞中的HIF-1α表达，表明此效应可能与HDAC6抑制有关。因此，RPE的保护效应可能不是由于TSP1的抗血管生成途径调节，而是通过抑制HDAC6-Hsp90轴抑制VEGF。
HDAC6-Hsp90轴中另一个有助于最小化感染动物视网膜组织损伤的因子是HSF1抑制。HSF1是分子伴侣合成的关键调节因子。本研究首次显示弓形虫感染使ARPE-19细胞中HSF1表达显著增加52%，TST治疗使感染ARPE-19细胞中HSF1表达下调77%。HSF1下调可能对视网膜组织产生保护作用。
组织病理学和超微结构分析显示，弓形虫感染动物视网膜出现RPE损伤、视网膜下迁移、细胞位移和明显脉络膜炎。单次TST注射后（感染后3或5天），均未观察到这些变化，表明与未治疗感染动物相比形态学得到高度保护。令人惊讶的是，这种保护也与视网膜寄生虫载量减少无关。但观察到TST治疗后缓殖子特异性标记BAG1减少。或许需要额外TST剂量或与标准疗法联合才能显著减少寄生虫载量。
抗炎效应对于急性感染期间感觉视网膜的组织保存至关重要。Iba-1参与干扰素-γ表达增加和对细胞内病原体如弓形虫的抗菌反应（M1表型）。感染后第15天，未治疗感染小鼠显示大量阳性细胞，表明微胶质细胞反应性。TST治疗后，标记细胞减少，与mRNA表达增加引起的Iba1转录负反馈一致。本研究观察到的Iba-1+细胞数量减少表明治疗降低了微胶质细胞活化和M1表型。
此外，TST降低了GFAP免疫荧光标记和Gfap表达，显示调节星形胶质细胞活化的效应。治疗恢复了米勒细胞节段中Glut-syn的分布，从而有利地调节构成内血视网膜屏障的细胞。TST治疗还调节了与弓形虫感染反应相关的免疫调节因子表达，如Tgfβ2，其在塑造视网膜免疫豁免中起关键作用。TST治疗将治疗感染动物中Tgfβ2表达恢复至未感染动物水平，并恢复了Il4、Il12和Il17的表达，这些因子在感染动物中低于基线水平。另一方面，治疗对Tnfα无相同效应，其在所有条件下均保持低水平。
OT炎症微环境以Th1和Th17反应的协调激活为特征。IL-12的产生显示出与急性感染期相容的模式，反映了初始强烈反应随后变得更受控制，可能与炎症通路耗竭或下调有关。Th17通路的激活由IL-17A持续增加证明。TST玻璃体腔注射治疗显著调节了这一炎症环境。观察到与Th1和Th17通路相关的细胞因子减少，表明TST可能干扰视网膜常驻细胞，如微胶质细胞和米勒细胞。已知HDAC抑制剂如TST可作用于NF-κB和STAT3依赖性转录通路，减少促炎基因表达。IL-6和IL-17A治疗后减少支持了TST限制Th17反应持续的假设。TST可在不废除局部免疫的情况下减轻炎症，这对于眼部感染性疾病至关重要，其中免疫与免疫病理之间的平衡至关重要。IL-12水平降低和IL-4恢复表明眼部免疫反应发生转变，减少了Th1活化并可能诱导调节表型。这些结果提示TST的免疫调节是维持眼部免疫豁免和保护视网膜组织免受弓形虫感染过度炎症损害的关键。
结论
鉴于当前疗法疗效有限且存在难治性疾病风险，筛选新化合物对于急性OT仍然至关重要。我们的研究结果表明，选择性HDAC6抑制赋予多方面的保护，其在保护外血视网膜屏障完整性中起核心作用。这些结果强调需要进一步研究以阐明HDAC6抑制剂介导的组织保护和免疫调节的分子机制。此外，本文采用的给药途径可能为代表对标准口服治疗无反应病例的一种有前景的治疗策略。
