双受体系统介导p-香豆酸感知与降解以增强细菌毒力的机制研究

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：A Dual-Receptor System Mediates p-Coumaric Acid Sensing/Degradation for Enhanced Bacterial Virulence

本研究揭示了猕猴桃溃疡病菌（Pseudomonas syringae pv. actinidiae, Psa）通过双功能系统（CasKR双组分信号系统与HcaR调控的hca基因簇）动态感知并降解宿主防御代谢物p-香豆酸（p-CA），从而逃逸植物免疫并恢复III型分泌系统（T3SS）介导的毒力。该发现阐明了植物-病原体化学军备竞赛的核心分子机制，为靶向细菌毒力而非生长的绿色防控策略提供新靶点。

　　

3.1. p-香豆酸在猕猴桃叶片提取物中抑制Psa_M228的T3SS

为评估宿主代谢物对Psa_M228毒力的影响，研究者首先发现猕猴桃“红阳”品种叶片粗提物可显著抑制T3SS关键基因hrpL的启动子活性。通过制备液相色谱分离获得6个组分，其中组分F对T3SS基因表达的抑制效果最强。代谢组学分析鉴定出p-香豆酸（p-CA）为该组分的核心活性物质。进一步实验表明，外源p-CA以浓度依赖性方式下调hrpL及T3SS结构基因转录，并显著降低Psa_M228在猕猴桃叶片中的致病力与定殖量，且不影响细菌生长。

3.2. p-CA通过结合传感器激酶CasK抑制T3SS

为解析p-CA的分子靶点，研究者构建了24个跨膜组氨酸激酶（HK）缺失突变体，发现仅ΔcasK突变体丧失p-CA对hrpL表达的抑制能力。CasK为杂交型HK，包含青霉素结合蛋白b（PBPb）传感结构域、PAS结构域、组氨酸激酶磷酸受体（His-KA）结构域和HK型ATP酶催化结构域（H-ATPase_c）。微量热泳动（MST）和等温滴定 calorimetry（ITC）证实p-CA直接结合CasK的PBPb结构域，解离常数（K_d）分别为4.16±0.19 μM（MST）和0.97±0.02 μM（ITC）。分子对接与点突变实验进一步揭示Gln75、Pro177和Gln220为p-CA结合的关键残基。

3.3. CasKR响应胞外p-CA调控细菌毒力与T3SS

ΔcasK与ΔcasR突变体均表现出毒力减弱和T3SS基因表达下调。外源p-CA处理使野生型菌株毒力降低约50%，而ΔcasK突变体毒力不受影响。回补野生型casK可恢复p-CA敏感性，但结合缺陷突变体casK^Q75A则无法回补。这些结果证实CasKR是p-CA感知并抑制T3SS的核心信号通路。

3.4. p-CA通过CasKR磷酸化级联调控T3SS表达

体外磷酸化实验显示，p-CA抑制CasK的自磷酸化及其向CasR的磷酸转移。CasK^H487A（磷酸化位点突变）和CasR^D54A（磷酸接收缺陷）突变体均丧失激活T3SS的能力，而CasR^D54E（磷酸模拟突变）则增强毒力与基因表达，表明p-CA通过阻断CasKR磷酸化级联抑制T3SS。

3.5. CasKR通过激活fleQ转录正向调控T3SS

DNA pull-down与电泳迁移率实验（EMSA）发现转录调控因子FleQ直接结合hrpL启动子。进一步实验表明，CasR通过结合fleQ启动子激活其转录，进而通过FleQ-HrpL轴调控T3SS。磷酸模拟型CasR^D54E对fleQ启动子亲和力显著增强，而磷酸缺陷型CasR^D54A丧失结合能力，证实磷酸化状态决定CasR的转录激活功能。

3.6. HcaR调控的hca基因簇介导p-CA降解并增强Psa毒力

Psa_M228通过保守的hca基因簇（编码4-羟基肉桂酰辅酶A连接酶FcS、苯甲醛脱氢酶VdH、4-羟基肉桂酰辅酶A水合酶/裂解酶EcH及MarR家族转录调节因子HcaR）降解p-CA。HcaR在无p-CA时抑制hca簇转录，而p-CA结合HcaR后解除其抑制功能。ΔhcaR突变体p-CA降解速率加快，且hca基因簇缺失突变体毒力显著减弱。时间进程实验显示，p-CA初期抑制hrpL表达，但随着其被降解，T3SS功能逐渐恢复。

机制模型

本研究提出双受体调控模型：宿主p-CA通过抑制CasKR磷酸化级联下调FleQ-HrpL-T3SS通路，削弱细菌毒力；而Psa_M228通过HcaR感知p-CA并激活hca簇介导的降解途径，中和宿主防御信号，重建毒力。这一动态互作揭示了植物-病原体化学军备竞赛的精细调控网络。