《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Single-cell transcriptomics reveals mechanisms of Galt gene editing–induced liver injury involving HGF–VEGF–mediated intercellular signaling in mice
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本综述深入探讨了Galt基因在维持肝脏健康中的关键作用。研究通过构建Galt (c.847 + 1G > T)基因编辑（GAL）小鼠模型，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、细胞通讯分析（CellChat）及分子生物学技术，揭示了Galt缺失导致肝损伤的新机制：即通过显著增强肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的细胞间通讯，引发肝细胞水肿、代谢紊乱和免疫细胞浸润，为半乳糖血症（Galactosemia）的肝病病理提供了新的见解和治疗靶点。
引言
半乳糖血症是一种由人类GALT基因（半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶）突变引起的罕见遗传性代谢疾病，其中I型半乳糖血症（GAL I）最为常见和严重。该疾病会导致半乳糖-1-磷酸异常积累，引发多器官损伤，尤其以肝脏损伤最为突出。尽管新生儿筛查和早期饮食管理降低了急性并发症的发生率，但许多患者仍面临认知障碍、言语迟缓和生殖系统功能障碍等长期慢性问题，这表明当前的治疗方法不足以完全逆转GALT基因突变引发的复杂病理过程。肝脏作为半乳糖代谢的中心器官，其结构和功能在半乳糖血症中会发生改变，但现有研究尚未彻底阐明这些变化的细胞和分子机制。为了更准确地模拟人类疾病病理，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了Galt (c.847 + 1G > T)基因编辑小鼠（GAL小鼠）模型，并应用单细胞转录组学（scRNA-seq）对肝脏进行了深入分析，旨在揭示Galt基因突变在细胞水平上影响肝损伤的机制。
Galt基因编辑（GAL）小鼠模型构建与表型分析
研究采用的GAL小鼠模型来源于先前的实验室工作。通过基因编辑设计、胚胎注射和移植等步骤，成功获得了移植胚胎小鼠。靶向区域的DNA桑格测序（Sanger sequencing）证实，Galt基因c.847 + 1G成功突变为T。经过交配繁殖，获得了GAL小鼠。与野生型（WT）小鼠相比，GAL小鼠体型明显更小，这与半乳糖血症的病理特征一致。在分子水平上，GAL小鼠肝组织中Galt的mRNA和蛋白表达水平均显著降低。肝脏形态学观察显示，WT小鼠肝脏坚实、表面光滑，而GAL小鼠肝脏松弛、表面粗糙不规则、颜色较浅且体积明显增大。肝脏指数分析表明，GAL小鼠的肝脏指数显著增加。此外，GAL小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著高于WT小鼠，提示存在严重的肝损伤。苏木精-伊红（H&E）染色结果进一步证实了GAL小鼠肝切片中存在肝细胞水肿。这些结果综合表明，Galt c.847 + 1G > T突变导致了GAL小鼠严重的肝损伤。
Galt基因编辑后肝脏细胞分布和基因表达谱的重塑
通过对所有样本的单细胞转录组数据进行整合，并经过质量控制和批次效应去除后进行聚类分析，利用UMAP图可视化了GAL和WT组的整体细胞布局。所有细胞被划分为11个主要簇。通过分析特征基因的表达，如Hnf4a（肝细胞）、Kdr（内皮细胞）、Clec4f（库普弗细胞）和Dcn（星状细胞），对这些簇进行了手动注释，最终将细胞分为五类：B细胞、内皮细胞、肝细胞、肝星状细胞（HSC）和库普弗细胞。比较Galt基因编辑前后肝脏组织中不同细胞类型的比例发现，GAL小鼠肝组织中库普弗细胞的比例显著增加，而肝细胞的比例略有下降。同时，肝星状细胞和内皮细胞的比例也有所增加，这表明Galt基因突变可能导致炎症细胞的聚集或增殖，从而改变了肝细胞群体的组成，并与肝组织中的免疫反应和炎症状态密切相关。
Galt基因编辑对细胞类型、基因表达及细胞通讯的影响
差异基因表达分析显示，在GAL小鼠中，肝细胞代谢相关基因的表达显著下调，而库普弗细胞和内皮细胞中炎症相关基因的表达显著上调。热图分析进一步揭示了不同细胞类型中差异基因的表达模式，支持了Galt基因编辑对不同细胞类型基因表达的功能性影响。利用CellChat工具进行的细胞通讯分析表明，GAL组推断的细胞间相互作用数量（394）和相互作用强度均显著高于WT组（366）。通路富集分析发现，在GAL组中，血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）信号通路的信息流显著增强。网络图显示，特别是在免疫细胞与肝细胞之间的通讯中，细胞相互作用的数量和强度在GAL组中显著更高。这表明Galt基因编辑不仅改变了细胞类型的组成和功能，还通过增强特定细胞群体之间的相互作用影响了整体肝脏功能。
Galt基因编辑对肝细胞亚型分布和功能的影响
基于单细胞转录组数据和关键标记基因，将肝细胞进一步分为四个主要亚型：Hep1、Hep2、Hep3和Hep4。Hep1亚型高表达代谢相关基因（如Asl、Arg1、Pck1）；Hep2亚型高表达胆固醇合成相关基因（如Hmgcs1、Fdps、Hmgcr、Msmo1）；Hep3亚型具有免疫调节特征，高表达Kng1、Apob、Vtn等基因；Hep4亚型则高表达解毒和氧化代谢相关基因（如Glul、Cyp2e1、Cyp3a11）。比较GAL组和WT组的肝细胞亚型组成发现，GAL组中Hep1和Hep2亚型的比例显著增加（Hep1从18.5%增至23.0%，Hep2从28.5%增至48.1%），而Hep3和Hep4亚型的比例显著减少（Hep3从45.4%降至22.8%）。差异基因表达分析显示，在Hep1和Hep2亚型中，多个代谢相关基因显著下调，而氧化应激相关基因上调；Hep3和Hep4亚型则表现出与小分子代谢和脂质代谢相关基因的更高表达。基因本体（GO）功能富集分析表明，肝细胞中上调的通路显著富集于胆固醇代谢和脂肪酸代谢等关键代谢过程，而下调的通路主要与内质网（ER）应激反应和蛋白质折叠相关。这些结果表明，Galt基因编辑显著影响了肝细胞亚型的分布，并通过调控关键基因的表达影响了各亚型的特定生物学功能。
Galt基因编辑对Hep3和Hep4亚型细胞通讯网络的影响
研究系统性地探讨了Galt基因编辑对肝脏中不同细胞类型之间细胞通讯网络的影响，重点关注了HGF和VEGF信号通路的变化。在Hep3和Hep4肝细胞亚型中，GAL组与WT组相比，细胞间通讯强度和模式存在显著差异。Hep3和Hep4亚型与其他细胞类型（如内皮细胞和肝星状细胞HSCs）的相互作用在GAL组普遍增强。配体-受体对分析进一步揭示，GAL组中HGF和VEGF信号通路在Hep3、Hep4亚型与内皮细胞、HSCs等之间的通讯活性显著增强。
Galt基因编辑对HGF和VEGF信号通路的影响
分析显示，在GAL基因编辑组中，不同细胞类型之间HGF-c-Met配体-受体对的通讯显著增加，特别是在Hep3、Hep4亚型与内皮细胞和HSCs之间的通讯强度明显增强。HGF信号通路差异表达点图证实了GAL组中多种细胞类型间HGF信号传导的统计学显著增加。类似地，VEGF信号通路在GAL组中也表现出增强的趋势，尤其是在与内皮细胞的通讯中。VEGF信号通路差异表达点图显示，GAL组中这些细胞类型之间VEGF配体-受体对的通讯显著增加。HGF和VEGF通路通讯强度的条形图清晰地展示了GAL组与WT组之间的差异。免疫荧光（IF）和蛋白质印迹（WB）实验也证实了HGF和VEGFA信号通路在GAL小鼠肝脏中的过表达。HGF信号的过度激活可能导致细胞外基质（ECM）异常沉积，影响肝细胞正常功能，引起炎症反应失调和肝细胞水肿。VEGF的过度激活同样可能导致ECM异常沉积，并增加血管通透性，促进炎症细胞浸润。这些发现表明，Galt基因编辑可能通过增强HGF和VEGF信号通路导致小鼠肝损伤。
Galt基因编辑对库普弗细胞和肝星状细胞功能通路的影响
对非实质肝细胞功能的GO富集分析显示，在库普弗细胞中，GAL组相较于WT组，小GTP酶介导的信号转导、吞噬作用、细胞组分大小调节和白介素-6（IL-6）信号等通路上调，表明免疫调节和吞噬功能增强。而下调的通路主要富集于脂肪酸代谢、类固醇代谢、小分子代谢、脂质转运和药物代谢，表明代谢活性降低。在肝星状细胞中，上调的通路与发育生长调节、细胞连接组装、细胞-基质粘附和肌动蛋白细胞骨架组织相关，暗示了细胞结构和发育功能的增强。下调的通路则主要与类固醇代谢、小分子代谢、脂质稳态和药物代谢相关，进一步表明代谢活性降低。总之，Galt基因编辑导致了库普弗细胞和肝星状细胞的通路重塑，表现为免疫调节、细胞结构维持的增强以及代谢功能的改变。
讨论
本研究通过构建GAL小鼠模型，并结合HE染色、免疫荧光、蛋白质印迹和单细胞转录组分析等技术，揭示了Galt基因编辑对肝脏结构和功能的严重损害，包括重塑细胞景观、破坏细胞间通讯网络和改变关键信号通路。Galt基因编辑引发了强烈的炎症反应，表现为肝指数升高、血清ALT和AST水平飙升以及H&E染色显示的广泛肝细胞水肿。单细胞转录组分析进一步揭示了主要肝细胞群体组成的变化，肝细胞比例略有下降，而库普弗细胞、内皮细胞和肝星状细胞比例激增，强调了Galt在维持肝组织平衡及其对肝脏免疫环境的影响。
亚型分析表明，Galt基因编辑显著影响特定的肝细胞亚型。代谢活跃的Hep1和Hep2亚型增加，而具有免疫调节作用的Hep3亚型减少。差异表达分析发现肝细胞中关键代谢基因下调，而库普弗细胞和内皮细胞中免疫相关基因表达激增，提示Galt缺陷可能阻碍代谢功能同时增强免疫反应。GO富集分析突出了Galt编辑细胞中代谢和应激反应通路的显著变化。肝细胞中脂肪酸和胆固醇代谢通路增强，可能是一种对代谢应激的代偿反应。而下调的内质网应激反应和蛋白质折叠通路则暗示了处理代谢应激和维持蛋白质质量控制方面可能存在缺陷。
CellChat分析显示细胞间通讯显著增加，尤其是HGF和VEGF信号通路。Hep3和Hep4亚型与内皮细胞或HSCs之间增强的HGF-Met和VEGF配体-受体对通讯，可能导致不受控制的炎症反应和肝细胞肿胀。VEGF信号上调可能通过增加血管通透性和ECM沉积，加剧肝细胞功能障碍和炎症。此外，HGF和VEGF通路之间的协同效应可能加剧这些反应。这种强化的细胞间信号可能反映了一种代偿机制，肝脏试图通过增强关键信号通路来减轻Galt基因缺失造成的损害。然而，如果这种代偿过度或方向错误，则可能加剧肝脏炎症和损伤。
与其他Galt基因编辑模型（如果蝇或斑马鱼）相比，本研究的GAL小鼠模型更详细地揭示了肝脏特异性病理。虽然之前的模型显示了Galt缺陷对发育和代谢的普遍影响，但本研究聚焦于肝脏，揭示了在非哺乳动物模型中未能完全捕捉的细胞组成、信号通路和细胞间通讯网络的具体变化。肝细胞亚型的显著变化以及HGF和VEGF通路的上调，凸显了Galt在维持肝脏稳态中作用的复杂性。
结论与未来方向
本研究通过单细胞转录组学和细胞通讯分析，揭示了Galt基因编辑对小鼠肝脏代谢、免疫和纤维化的显著影响。Galt基因的缺失不仅导致肝脏细胞组成和基因表达谱的重塑，还深刻影响了细胞间通讯网络。VEGF和HGF等关键信号通路的显著上调可能是导致肝细胞水肿和炎症细胞浸润，从而加剧肝损伤的关键因素。未来的研究可以进一步探索如何通过靶向这些关键信号通路来缓解Galt基因编辑引起的肝损伤。本研究为理解Galt基因在肝脏代谢和免疫调节中的作用提供了新的见解，并为半乳糖血症的治疗策略提供了潜在靶点。
研究的局限性
本研究的一个局限性是胆管细胞和淋巴细胞的捕获率较低，未能形成清晰的簇。因此，我们的数据集未能完全捕捉肝脏微环境。 consequently，细胞-细胞通讯分析仅限于五种主要细胞类型，未能评估与胆管细胞或淋巴细胞的相互作用。因此，关于免疫调节和细胞间信号传导的结论应谨慎解读。缺乏去除环境RNA和双联体的专门方法代表了一个技术局限性。尽管如此，高质量的数据和清晰的细胞群体分离支持了我们结论的稳健性。
材料与方法
本研究使用的所有小鼠均为C57BL/6J品系，随机分配性别，周龄8-10周，体重18-22克。它们被饲喂SPF级实验室繁殖饲料，并在安乐死前禁食12小时。所有实验均获得桂林医学院机构动物护理和使用委员会的批准（许可代码：GLMC202103279）。针对小鼠Galt基因序列（ENSMUST00000084695.12）进行分析，将Galt c.847 + 1G（内含子9的第一个碱基，一个保守的剪接位点）作为靶点，旨在引入G到T的突变，破坏正常外显子剪接，产生截短蛋白。设计了靶向该位点的单向导RNA（sgRNA）和单链寡核苷酸（ssODN）作为同源重组模板。将化学合成的sgRNA、ssODN和Cas9蛋白显微注射到受精卵中，移植到假孕雌鼠输卵管中，从而建立Galt基因编辑小鼠模型。通过尾组织基因DNA提取、PCR扩增靶向区域和桑格测序进行基因型分析，并通过繁殖获得纯合GAL小鼠模型。
通过定量RT-PCR（qPCR）和蛋白质印迹（WB）检测GAL小鼠和WT小鼠肝组织中Galt基因的mRNA和蛋白表达水平。肝组织经固定、石蜡包埋、切片后进行H&E染色观察病理变化。用于单细胞RNA测序的肝组织样本经过解离、红细胞裂解、细胞计数和活力评估后，使用磁珠试剂盒去除细胞碎片和死细胞，最终将细胞重悬于含有0.04%牛血清白蛋白（BSA）的1×PBS中，调整细胞密度至1×106个细胞/毫升。
使用SeekOne?数字液滴单细胞文库构建试剂盒构建单细胞RNA测序文库。将细胞与逆转录试剂混合后加载到SeekOne?芯片上，利用独特的条形码水凝胶珠（BHBs）和油相技术生成高度稳定的液滴乳液。在42°C下进行逆转录90分钟，80°C加热15分钟终止反应。cDNA从液滴中分离纯化后经PCR扩增，随后进行片段化、末端修复、加A尾、连接测序接头，最后通过索引PCR扩增并获得最终文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行PE150测序。
原始测序数据经过质量控制和比对参考基因组GRCm38（mm10）后，生成基因表达矩阵。使用Seurat R软件包进行数据降维和聚类分析，包括质量控制、归一化、缩放、Harmony算法整合批次效应、主成分分析（PCA）、寻找最近邻和细胞聚类，并通过UMAP算法可视化聚类结果。使用Seurat的FindAllMarkers函数进行差异基因表达分析，并基于特征标记基因和CellMakerDB、PanglaoDB参考数据库对每个细胞簇进行细胞类型注释。使用clusterProfiler R包对差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析。使用CellChatDB数据库进行配体-受体相互作用分析，探索GAL组和WT组之间的细胞间通讯。
通过眼眶静脉穿刺采集血液，离心分离血清，使用兽医生化分析仪检测血清ALT和AST水平。小鼠安乐死后取出肝脏，称重计算肝脏指数（肝脏重量mg/体重g）。通过免疫荧光染色和蛋白质印迹验证HGF和VEGF信号通路相关蛋白（HGF、VEGFA、KDR、c-MET）的表达。所有数据使用GraphPad Prism 9软件进行分析，两组间比较采用Student t检验，数据以均值±标准差表示，p < 0.05认为具有统计学显著性。
