《Frontiers in Molecular Neuroscience》：Hsd17b7 undergoes dynamic subcellular localization during Neuro2a differentiation
编辑推荐：
本研究通过活细胞成像与免疫荧光技术，首次系统揭示了胆固醇合成酶Hsd17b7在神经分化过程中的动态亚细胞定位特征。该酶不仅定位于内质网（ER）与核膜，更在分化早期出现于神经突（neurites）内，为理解胆固醇代谢异常导致神经发育障碍的机制提供了新的亚细胞层面视角。
引言
胆固醇生物合成途径中的酶，特别是角鲨烯后合成阶段的酶，与神经发育异常密切相关。单个酶的改变会表现出独特的大脑表型，表明每种酶在哺乳动物神经细胞中具有 distinct 的作用。然而，为了理解这些差异，对胆固醇生物合成酶进行全面表征的研究尚未完全完成。因此，本研究旨在通过表征胆固醇生物合成酶羟基类固醇-17-β脱氢酶7（Hsd17b7）在哺乳动物神经细胞系中的亚细胞定位，为这一不断增长的知识体系做出贡献。
材料与方法
本研究使用小鼠Neuro2a细胞，比较了内源性Hsd17b7和GFP标记构建体的表达模式。通过共聚焦显微镜，研究人员注意到Hsd17b7在高尔基体和溶酶体中缺失，同时确认了其在内质网中的存在。有趣的是，还观察到其与核膜的共定位，这一点此前尚未被证实。在24小时血清剥夺诱导分化后，分化细胞中的Hsd17b7-GFP模式仍在细胞体中观察到，与未分化细胞中所见一致。然而，也观察到了GFP阳性蛋白在MAP2阳性神经突内定位的证据。Hsd17b7抗体与共轭鬼笔环肽的共染色进一步支持了Hsd17b7在发育中神经突内的定位。
结果
比较GFP标记和内源性Hsd17b7
作为跨膜蛋白，Hsd17b7的C末端位于胞质面，而N末端突出到膜的非胞质面。在未分化Neuro2a细胞中的转染实验结果显示，N末端标记的Hsd17b7-GFP信号定位于DNA标记Hoechst周围。虽然先前的研究表明C末端标记的Hsd17b7会出现胞质定位，但本研究观察到了与N末端GFP构建体相似的模式。在这两种情况下，GFP信号在细胞一侧不对称积累，并在Hoechst DNA染色周围形成细线。这表明该蛋白可能定位于核周围结构，包括核膜和内质网。与内源性Hsd17b7蛋白相比，质粒产生的信号强度更高，这符合GFP标记质粒会过度表达靶蛋白的预期。与GFP标记的Hsd17b7结果相似，抗体染色显示该蛋白位于Hoechst DNA染色周围，核区内无广泛染色。相比之下，对照pCAG-GFP质粒在胞质和核区内均产生非特异性信号。共染色实验证实Hsd17b7-GFP质粒确实代表了Hsd17b7蛋白。鉴于N末端标记因其腔面取向而更稳定，本研究后续均使用N末端标记的Hsd17b7质粒。
Hsd17b7定位于Neuro2a细胞的内质网和核膜
尽管推测该酶主要定位于哺乳动物细胞的内质网，但像其他角鲨烯后生物合成酶一样，Hsd17b7在未分化Neuro2a细胞中也与核膜相关。Emerin是一种存在于内核膜、外核膜和周围内质网中的蛋白质。Emerin免疫染色结果与近期在小鼠原代神经元培养中的发现一致，突出了核被膜以及内质网。与pCAG-GFP不同，观察到Emerin和Hsd17b7-GFP之间存在重叠模式。使用ER Tracker在活体未分化Neuro2a细胞中进一步支持了Hsd17b7在内质网的定位。GFP转染细胞的亚细胞分级分离结果进一步支持了Hsd17b7与核被膜的共定位，结果显示虽然大部分Hsd17b7-GFP蛋白出现在胞质组分中（与内质网定位一致），但一小部分也出现在核组分中。用核被膜蛋白Lamin A/C染色也显示与Hsd17b7-GFP重叠的模式，进一步支持该蛋白与核膜相关。
此外，还研究了Hsd17b7是否定位于胆固醇合成角鲨烯后部分其他酶曾有报道的区室。已有报道称，位于该通路中Hsd17b7上游的酶Nsdhl定位于高尔基体。使用抗高尔基体驻留蛋白RCAS1的抗体，未观察到与Hsd17b7的共定位。这些结果在对照pCAG-GFP质粒中也得到反映。此外，在细胞的溶酶体区室中未观察到Hsd17b7-GFP或pCAG-GFP质粒的共定位。
Hsd17b7存在于分化中的Neuro2a细胞的神经突中
鉴于Hsd17b7缺失与早熟分化和异常神经膜动力学相关，研究人员调查了神经分化过程中的蛋白定位。为了模拟此过程，在转染后24小时进行血清饥饿以诱导神经突形成。确实，在血清剥夺后，观察到血清耗竭组（0% FBS, 0.1% BSA）的神经突数量相较于10% FBS对照组显著增加（p < 0.001）。当在转染后24小时进行分化时，在分化细胞中观察到Hsd17b7-GFP围绕DNA标记Hoechst，与在未分化细胞中的观察相似。然而，也观察到了GFP在MAP2阳性神经突内的模式。MAP2突出显示了树突内的微管，支持了Hsd17b7可以定位在这些结构内的发现。此外，用内源性Hsd17b7抗体和鬼笔环肽（突出显示细胞内的丝状肌动蛋白F-actin）染色得到了相似的结果。F-actin可存在于轴突和树突中，表明Hsd17b7在神经分化过程中可能不仅限于树突。通过将抗体染色与pCAG-GFP转染相结合，进一步证实了Hsd17b7在神经突中的存在。鉴于pCAG-GFP质粒的普遍性，这进一步突出了神经突结构，并支持了Hsd17b7蛋白存在于细胞体之外。
讨论
总体而言，本研究支持了先前的发现，同时扩展了关于Hsd17b7在哺乳动物神经细胞内定位的知识。鉴于蛋白质定位可能在哺乳动物细胞类型间存在差异，本研究旨在在神经特异性细胞系中确定Hsd17b7的位置。已有报道称Neuro2a细胞与原代神经元在蛋白质定位上具有相似性，从而为神经分化过程中的定位提供了模型。此外，虽然先前的研究报道了其在非神经细胞中的定位，但Hsd17b7尚未在神经特异性细胞系中得到全面表征。因此，研究人员在小鼠Neuro2a细胞中进行了荧光显微镜实验。这些细胞源自神经嵴，已成为神经分化研究的标准模型，能够在血清剥夺后24小时内分化为神经元。虽然我们的数据支持了关于Hsd17b7定位于内质网的现有信息，但我们也确定了该蛋白与核膜的定位。相反，未观察到其与高尔基体或溶酶体的定位。此外，我们对此蛋白在发育中神经元内的位置提供了新的见解，观察到了其在发育中神经突结构内的定位。有必要进一步研究该蛋白如何以及为何位于这些结构内，以确定其对神经分化的潜在影响。
GFP标记蛋白的使用已被证明是理解真核细胞中蛋白质定位的有效方法；然而，GFP标签在C端或N端的位置可能会影响定位。在比较N端和C端标记的构建体时，我们的结果与先前一项报道C端标记的Hsd17b7仅限于胞质定位的研究形成对比。然而，一项较新的研究表明，C端标记的Hsd17b7能够定位于非胞质区域，这与我们的发现一致。我们确实发现GFP构建体的模式与我们的Hsd17b7抗体有相似之处，但GFP构建体产生的信号更强。这是预期的，因为该构建体会瞬时过度表达Hsd17b7蛋白。鉴于观察到模式的一致性，使用抗体或GFP质粒均能代表Neuro2a细胞中Hsd17b7的定位。
我们的发现得到了早期在非神经细胞中研究的支持，那些研究中该蛋白被鉴定存在于内质网。内质网是哺乳动物细胞中最大的多功能细胞器，具有多种作用，包括脂质修饰、生物合成和调节细胞内钙。这种定位也与Hsd17b7在甾醇和类固醇生物合成中的作用一致，已知这些过程发生在内质网。
尽管推测该酶主要定位于哺乳动物细胞的内质网，但像其他角鲨烯后生物合成酶一样，Hsd17b7也与其他区室如核膜相关。鉴于外内质网膜与核膜是连续的，Hsd17b7可能具有膜流动性或在核膜本身内有特定作用。此外，虽然胆固醇生物合成途径中的其他甾醇脱氢酶，如Nsdhl，曾有报道存在于溶酶体中，但我们未观察到Hsd17b7定位到这些区室。这一点尤其有趣，因为Nsdhl参与角鲨烯后生物合成的相邻步骤，然而这两种酶在定位上显示出多样性。这进一步强调这些酶可能在神经细胞内具有独特的作用。
虽然有报道称胆固醇生物合成不发生原代神经元的轴突中，但其他研究已显示证据表明胆固醇生物合成酶有可能存在于这些结构中。例如，最近一项研究的数据显示Dhcr24存在于小鼠原代神经元的神经突中。此外，胆固醇生物合成的消除与原代神经元神经突生长减少有关。Hsd17b7功能缺失与分化过程中异常的神经突结构相关。具体而言，源自Hsd17b7突变小鼠的原代神经元显示出显著更少的板状伪足/丝状伪足，并且与对照组相比，表现出加速成熟并形成初级轴突。这一点特别值得关注，因为我们在Neuro2a细胞中沿着推测的轴突结构观察到了Hsd17b7。鉴于Hsd17b7与内质网的关联，它很可能由于内质网运输而存在于神经突结构中。确实，有数据显示胞体中的内质网连续地延伸到发育中神经元的轴突和树突中，并在轴突发育和突触连接中发挥作用。虽然粗面内质网似乎局限于胞体和树突结构，但滑面内质网延伸至轴突全长。进一步研究Hsd17b7如何通过这些途径（无论是通过胆固醇生物合成和/或类固醇生物发生途径）影响这些结构将很有意义。
