《Veterinary Research Communications》：Effects of cecropin A on cytokine production and tight junction protein expression in chicken ileal explant cultures
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本研究针对畜禽养殖中抗生素耐药性(AMR)日益严峻的背景下，探索宿主防御肽(HDPs)作为替代策略的潜力。研究人员以鸡回肠外植体为模型，聚焦天蚕素A(CecA)对肠道免疫平衡及上皮屏障功能的影响。结果表明，CecA在无细胞毒性前提下，可上调IL-2、下调IL-6水平，并增强claudin-3蛋白表达，提示其具有调节肠道免疫反应和强化上皮完整性的双重作用，为家禽肠道健康管理提供了新的候选分子机制。
在抗生素耐药性(AMR)日益成为全球公共卫生与畜牧养殖业严峻挑战的今天，寻找传统抗生素的替代品已成为当务之急。家禽养殖业尤其面临巨大压力，一方面需要满足市场对禽肉不断增长的需求以保障动物生产性能，另一方面，抗生素的失效使得传染病的防控变得愈发困难。肠道作为抵御病原体的第一道防线，同时承受着高强度饲喂带来的负担，其健康状态直接关系到动物的整体健康和生产效率。因此，维持肠道内环境稳定，即肠道稳态，至关重要。肠道上皮的完整性依赖于局部免疫状态和调控通路，其中由Toll样受体(TLRs)介导的病原识别及随之产生的细胞因子风暴，以及紧密连接(TJ)蛋白构成的物理屏障，共同维系着这道脆弱防线。一旦平衡被打破，便可能引发局部乃至全身性病理变化。
在这一背景下，宿主防御肽(HDPs)，亦称抗菌肽，因其广谱的抗菌活性和独特的免疫调节功能，被视为极具潜力的抗生素替代候选者。这些由生物体先天免疫系统产生的小分子 cationic 肽，不仅能直接杀伤微生物，更能“巧妙”地调节宿主细胞功能，以间接方式对抗感染。在禽类肠道健康方面，HDPs被证实可调节炎症信号通路、改善肠道形态、影响TJ蛋白表达等。然而，这些效应因具体肽段和实验条件的不同而存在显著差异，因此对每一种HDP的作用机制进行细致研究显得尤为重要。
在众多HDPs中，来源于昆虫的天蚕素家族因其分子量小、结构优势、对真核细胞低毒性以及兼具直接和间接抗菌活性而备受关注。天蚕素A(CecA)作为该家族中被广泛研究的成员之一，是一种由37个氨基酸残基组成的肽，已在猪、牛、小鼠乃至家禽中显示出强化细胞稳态的潜力。但其对家禽肠道细胞的具体作用机制尚待深入阐明。
为此，发表在《Veterinary Research Communications》上的本研究，旨在利用鸡回肠外植体培养模型，精确探究CecA对肠道免疫反应和TJ蛋白表达的影响。相较于单层细胞系，外植体模型能更好地保留肠道黏膜复杂的细胞组成和细胞极性结构，从而更真实地模拟体内过程。
研究人员首先建立了鸡回肠外植体培养体系。从21日龄罗斯308肉公鸡截取回肠段，经严格清洗后，使用活检穿孔器获取直径1.5毫米的组织外植体，并培养于经胶原包被的96孔板中。为评估CecA的作用，实验设置了六个处理组：空白对照、低浓度CecA(3.125 μg/mL)、高浓度CecA(6.25 μg/mL)、Poly I:C (50 μg/mL，TLR3激动剂，用于诱导炎症)、以及Poly I:C分别与低、高浓度CecA的组合。处理12小时后，收集培养上清液和组织裂解液用于后续检测。
主要技术方法包括：通过CCK-8法和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测评估细胞活力和细胞膜完整性；利用Luminex xMAP技术和ELISA试剂盒检测白细胞介素(IL)-2、IL-6、干扰素(IFN)-γ、RANTES、IL-8和转化生长因子(TGF)-β1等细胞因子浓度；通过竞争性ELISA和定量夹心ELISA分别检测TJ蛋白occludin和claudin-3的胞内表达水平。数据分析采用R语言进行非参数检验。
细胞活力
通过检测细胞代谢活性和细胞外LDH活性评估细胞毒性。结果显示，除Poly I:C单独处理能显著降低细胞代谢活性外，CecA单独或其与Poly I:C联合处理均未对细胞活力产生显著影响，表明所用浓度的CecA在鸡回肠外植体模型中应用安全。
细胞因子浓度
在免疫状态方面，研究发现高浓度CecA单独处理能显著提升IL-2水平；在Poly I:C诱导的炎症背景下，高浓度CecA同样表现出提升IL-2的作用。IL-6的浓度则在Poly I:C与低浓度CecA联合处理组中显著降低。Poly I:C单独处理能显著升高IFN-γ和RANTES的水平，但CecA的加入并未改变这一效应。各处理对IL-8和TGF-β1的浓度均无显著影响。这些结果提示CecA具有免疫调节活性，能特异性影响某些细胞因子的分泌。
紧密连接蛋白丰度
在TJ蛋白表达方面，高浓度CecA单独处理显著提高了claudin-3的胞内表达水平，而各处理对occludin的丰度均无显著影响。这表明CecA对增强上皮屏障完整性有积极作用，且这种作用可能具有蛋白特异性。
本研究得出结论，天蚕素A在鸡回肠外植体模型中未表现出细胞毒性，表明其应用安全性。更重要的是，它展现出免疫调节功能，能够上调IL-2并下调IL-6的产生。同时，CecA通过增强claudin-3的表达，支持了肠道上皮屏障的完整性。因此，CecA被认为对鸡肠道健康具有有益影响，未来有望作为支持家禽肠道稳态的潜在工具。讨论部分指出，HDPs的作用具有多样性，常依赖于具体的浓度、物种和组织环境。本研究的发现与在其他物种（如猪、鼠）中使用CecA或其他天然天蚕素的研究结果部分一致，但也存在差异，这凸显了在不同模型系统中细致研究HDPs功能的必要性。尽管本研究存在未探究深层信号通路、组织学变化以及所用浓度范围有限等局限性，但其结果为进一步探索CecA在禽类肠道健康中的应用奠定了坚实基础，强调了其在后抗生素时代家禽养殖中的潜在价值。
