《Cellular and Molecular Neurobiology》：FDCA Attenuates Neuronal Ferroptosis and Reduces Hemorrhagic Transformation After Ischemic Stroke with High Glucose
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本研究针对高血糖加剧缺血性脑卒中后出血性转化（HT）这一临床难题，首次报道了新型化合物法舒地尔二氯乙酸盐（FDCA）通过协同抑制ROCK/p-MYPT1和PDK/p-PDH通路，下调ACSL4、上调GPX4表达，显著抑制神经元铁死亡，从而降低HT面积、改善神经功能并降低死亡率。该研究为HT的临床治疗提供了多靶点干预新策略。
脑卒中已成为全球第二大死亡原因，其中缺血性脑卒中占比超过80%。出血性转化（Hemorrhagic Transformation, HT）作为缺血性脑卒中后常见且凶险的并发症，尤其在合并高血糖的患者中发生率显著升高，严重加剧致残率和死亡率。目前，临床上仍缺乏有效防治HT的特异性药物。铁死亡（Ferroptosis），一种铁依赖性的新型调节性细胞死亡方式，在缺血性脑损伤中被证实扮演关键角色，但其在HT病理进程中的作用，尤其是高血糖背景下的具体机制，尚不明确。
在这一背景下，研究人员将目光投向了一种新型化合物——法舒地尔二氯乙酸酯（FDCA）。它是由已获批临床使用的Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK）抑制剂法舒地尔（Fasudil, F）与丙酮酸脱氢酶激酶（Pyruvate Dehydrogenase Kinase, PDK）抑制剂二氯乙酸盐（Dichloroacetate, DCA）通过成盐反应合成，旨在发挥协同多靶点治疗效应。先前研究表明FDCA在脑缺血中具有神经保护作用，但其能否改善HT，特别是其作用机制是否与调控神经元铁死亡相关，仍有待揭示。本研究旨在探究FDCA对高血糖状态下缺血性脑卒中后HT的影响及其潜在机制。
研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术方法：首先，建立了急性高血糖联合短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAO）诱导的大鼠HT模型，模拟临床常见危重情况；其次，通过脑组织切片染色、血红蛋白含量测定及神经功能评分（Longa评分和改良Garcia评分）系统评估了FDCA对HT严重程度和神经功能缺损的改善作用；接着，综合运用蛋白质免疫印迹（Western Blotting）、免疫荧光染色、DAB增强普鲁士蓝染色以及生化检测（脂质过氧化物LPO、丙二醛MDA、谷胱甘肽GSH含量测定）等技术，在体（大鼠脑组织）外（人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞）水平深入探讨了FDCA对铁死亡关键分子和信号通路的影响；最后，利用GPX4抑制剂RSL3诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡模型，验证了FDCA的直接抗铁死亡作用。实验所用SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
FDCA administration suppresses brain injury and reduces mortality in rats with hemorrhagic transformation after ischemic stroke combined with high glucose
研究发现，在tMCAO造模后2小时和4小时腹腔注射FDCA（10 mg/kg），能显著降低高血糖大鼠的脑HT面积、HT评分和脑组织血红蛋白含量，改善Longa评分和改良Garcia评分所评估的神经功能缺损，并有效降低模型大鼠24小时内的死亡率。这表明FDCA对高血糖合并缺血性脑卒中后的HT具有明确的保护作用。
FDCA was superior to F, DCA, and F+DCA administration for reducing hemorrhagic transformation
研究进一步对比了FDCA与其母核药物F、DCA以及F与DCA物理混合物（F+DCA）的疗效。结果显示，等效剂量下，FDCA在减小HT面积、降低血红蛋白指数以及改善神经功能评分方面的效果均优于F、DCA单药或其物理混合物，凸显了FDCA作为单一化合物的协同治疗优势。
FDCA administration decreases iron and ferroptosis biomarkers in the peri-hematomal area following cerebral hemorrhagic transformation
机制探索发现，HT后大鼠血肿周围脑组织存在明显的铁过载（DAB增强普鲁士蓝染色显示铁沉积增加）、脂质过氧化水平升高（LPO和MDA含量显著上升）以及抗氧化物质GSH的耗竭。FDCA治疗能有效逆转这些变化，显著降低铁沉积、LPO和MDA水平，并恢复GSH含量，提示FDCA能够缓解HT后的铁过载和铁死亡过程。
FDCA suppresses ferroptosis in a rat model of cerebral hemorrhagic transformation through downregulation of MYPT1 and PDH phosphorylation levels
Western Blotting分析表明，HT后，血肿周围脑组织中铁死亡正调控因子长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）蛋白表达上调，而关键负调控因子谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达下调。FDCA处理能显著下调ACSL4、上调GPX4蛋白表达。同时，FDCA还降低了ROCK下游底物肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（MYPT1）和PDK下游底物丙酮酸脱氢酶（PDH）的磷酸化水平，表明其同时抑制了ROCK和PDK的活性。
FDCA inhibits neuronal ferroptosis in the brain of rats with cerebral hemorrhagic transformation
免疫荧光染色结果明确显示，铁死亡标志物ACSL4的表达增加和GPX4的表达减少主要发生在神经元（与NeuN共定位），而非内皮细胞（CD31阳性）或小胶质细胞（Iba1阳性）。这表明神经元是HT后发生铁死亡的主要细胞类型，FDCA能特异性抑制神经元的铁死亡。
FDCA attenuates ferroptosis in RSL3-treated SH-SY5Y cells
在体外的SH-SY5Y细胞实验中，FDCA（5μM）预处理能够显著减轻GPX4抑制剂RSL3诱导的细胞损伤（降低乳酸脱氢酶LDH释放）、改善细胞形态，并降低细胞内的LPO和MDA水平、恢复GSH含量。Western Blotting结果同样证实FDCA能下调ACSL4、上调GPX4表达，并降低p-MYPT1和p-PDH水平，与体内实验结果相互印证。
综上所述，本研究证实，新型化合物FDCA能有效减轻高血糖状态下缺血性脑卒中后的出血性转化，其保护作用优于其组分药物单用或联用。作用机制上，FDCA通过协同抑制ROCK/p-MYPT1和PDK/p-PDH信号通路，调控铁死亡关键执行蛋白ACSL4和GPX4的表达，从而特异性抑制神经元铁死亡，最终改善卒中结局。该研究不仅揭示了神经元铁死亡在HT病理进程中的关键作用，也为临床开发防治HT的多靶点药物提供了有前景的候选化合物FDCA。尽管本研究存在未能完全阐明FDCA如何精确通过ROCK或PDK通路调控铁死亡相关蛋白、以及模型未能完全模拟临床患者所有风险因素（如老龄化）等局限性，但其发现无疑为攻克缺血性脑卒中后出血性转化这一临床难题开辟了新的思路和方向。
