微流控混合器件内流体动力学与纳米载体成核的原位成像研究

《Lab on a Chip》：In situ imaging of fluid dynamics and nanocarrier nucleation inside microfluidic mixing devices

本文开发了一种结合共聚焦拉曼显微镜（CRM）、共聚焦荧光显微镜（CFM）和福斯特共振能量转移显微镜（FRET）的新型三维分析工具集，实现了在蛇形微混合器内对溶剂流体动力学及脂质体原位自组装过程的实时空间分辨监测，为微流控制备纳米载体的机理研究、工艺优化和质量控制提供了强大手段，有望推动纳米药物的大规模工业化生产。

　　

微流控技术作为一种强大的纳米颗粒制备平台，能够实现纳米载体尺寸和分布的可控定制，并具有良好的重复性。然而，尽管其在实验室研究中展现出巨大潜力，但在向工业化规模放大转化过程中仍面临挑战，主要瓶颈在于对微混合器内部流体动力学、溶剂稀释过程以及纳米载体成核机制缺乏直接、实时的三维观测手段。传统表征方法如计算流体动力学模拟和荧光示踪技术大多只能提供间接的、通常是二维的 insights，限制了其在放大生产和符合监管要求方面的预测价值。

为了弥补这一方法论上的空白，本研究建立了一套创新的、互补的分析工具集，旨在实现对微流控器件内部流体行为、流体相混合以及纳米载体原位形成的直接监测。研究采用了一种基于Kimura等人设计的蛇形微混合器模型，该器件具有20个交替排列的矩形挡板，能够周期性地收缩和扩张流道宽度，从而产生交替的流体收缩和扩张区域。微流控器件通过使用3D打印模具的软光刻技术制备，其尺寸精度通过扫描电子显微镜确认，偏差低于5%。

总流速对粒径的影响

作为微流控混合系统最常用的表征指标，研究者首先通过动态光散射分析了在不同总流速下制备的脂质体的粒径和多分散性指数。结果表明，脂质体的流体动力学直径随着总流速的增加而显著减小，从总流速为50 μL min^-1时的116 nm下降到300 μL min^-1时的约60 nm，并在更高的流速下趋于稳定在45 nm左右。多分散性指数值普遍低于0.2，表明样品具有良好的单分散性。这种粒径减小现象归因于随着混合效率提高，乙醇相被更快速地稀释，限制了脂质盘状中间体在囊泡闭合前的生长时间。

流体动力学与乙醇稀释机理的表征

为了深入理解粒径变化的流体动力学基础，研究团队系统性地改变了总流速，并综合运用计算流体动力学模拟、共聚焦荧光显微镜和共聚焦拉曼显微镜对微通道内的流体行为进行了详细分析。计算流体动力学模拟预测了由于交替挡板结构产生的曲折流路，以及在低雷诺数和迪恩数下的严格层流状态。随着流速增加，模拟显示在挡板角落的低流速、低压区域出现了大涡流，而在挡板的50 μm宽收缩处内部形成了较小的涡流。共聚焦荧光显微镜使用罗丹明B作为荧光示踪剂，在中等通道高度下对整个挡板结构进行了可视化，确认了在低流速下两相的清晰分离。随着流速升高，观察到二次流动结构的出现，例如迪恩涡流，这导致了相分离和三维流动模式。共聚焦拉曼显微镜作为一种无标记技术，通过采集每个扫描点的拉曼光谱，并应用经典最小二乘法来区分磷酸盐缓冲盐水、乙醇和聚二甲基硅氧烷，从而生成乙醇浓度图。共聚焦拉曼显微镜的结果与共聚焦荧光显微镜相互印证，显示了乙醇浓度梯度沿通道的逐渐降低，并揭示了在较高流速下流动对称性的破坏和复杂三维涡流的形成。

FRET显微镜检测脂质体

为了直接可视化颗粒形成过程，研究采用了福斯特共振能量转移技术。将疏水性FRET染料对DiO和DiI与磷脂DOPC一同加入乙醇相中。当脂质在微流控通道内形成脂质双层时，两种染料会嵌入到膜中，其紧密接近导致FRET效率增加。共聚焦荧光显微镜测量结果显示，只有当两种染料和脂质同时存在时，才能在乙醇相和磷酸盐缓冲盐水流的界面处观察到显著的FRET效率提升，这表明了脂质体的成功形成。作为对照，仅使用单一染料或缺少脂质的实验组均未检测到显著的FRET效率。

CRM检测囊泡形成

作为FRET实验的补充，拉曼显微镜提供了关于脂质物理化学状态的无标记、定量信息。为了避免乙醇和脂质的C-H谱带重叠，实验使用了氘代乙醇。通过分析特定振动谱带（如CH_a~2846 cm^-1和 CH_b~2965 cm^-1）的积分比，发现该比值在通道不同位置有所变化：在乙醇相中比值较低，在相界面处升高，而在磷酸盐缓冲盐水相中最高。将CH_b/CH_a比值在选定的挡板横截面上进行绘图，结果显示在乙醇相和磷酸盐缓冲盐水的界面处比值约为3-4，这与脂质自组装区域相符。

原位脂质体检测

通过结合FRET效率图和拉曼光谱的CH_b/CH_a比值图，研究实现了对微流控装置内不同位置脂质自组装过程的原位评估。在总流速为100 μL min^-1时，FRET效率图显示沿着通道，信号密度逐渐增加，且高FRET效率区域主要集中于对应于乙醇相的区域，特别是在乙醇与磷酸盐缓冲盐水的界面处最高。相应的拉曼数据也显示出类似的CH_b/CH_a比值空间分布模式，在相界面处观察到特征性的比值。这些空间分布模式（如镜像C形和火山状图案）与共聚焦荧光显微镜和共聚焦拉曼显微镜观察到的流体动力学特征一致，共同证实了脂质体形成主要发生在水相和乙醇相的界面处。

讨论

本研究通过整合多种先进显微镜技术，成功实现了对微流控纳米沉淀过程中溶剂稀释动力学和纳米载体成核的直接、三维、实时观测。研究发现，颗粒形成主要由界面处的溶剂交换驱动，并且流动模式（如迪恩涡流和压力梯度驱动的再分布）显著影响混合效率和最终的颗粒尺寸。互补使用的共聚焦荧光显微镜和共聚焦拉曼显微镜提供了相互支持的结果，共聚焦荧光显微镜适用于快速的几何优化和工艺开发，而共聚焦拉曼显微镜则为无标记的过程质量控制提供了可能。结合增材制造技术，这种综合分析方法为理性设计微混合器、优化工艺参数以及推动纳米治疗药物的可扩展工业化生产铺平了道路。

结论

本研究通过建立一套互补的三维分析工具集，填补了微混合器表征方法学的空白，实现了对流体行为、流体相混合和纳米载体原位形成的直接监测。共聚焦拉曼显微镜和福斯特共振能量转移显微镜的集成，使得在微通道内对纳米载体成核进行空间分辨的实时成像成为可能。这不仅增进了对成核机理的理解，也为未来的工艺工程、优化和控制建立了强大的工具集。结合增材制造技术，这种方法有望加速纳米尺寸治疗药物的工业化大规模生产。