《RSC Chemical Biology》：Double-hit approach for novel glycoconjugates combining cytoplasmic glycoengineering and selective chemistry
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本综述创新性地提出了一种"双重打击"策略，结合细胞质糖工程与选择性化学，用于开发新型糖缀合物疫苗。该策略通过胞质糖基化（利用ApNGT和LgtB）在目标蛋白（如MrkA）上引入特异性糖柄（如乳糖），再通过高碘酸钠（NaIO4）氧化和还原胺化实现多糖（如K2 K-抗原和O1v1 O-抗原）的特异性偶联。研究表明，K2-MrkA结合物能有效诱导抗菌抗体，且不损害蛋白免疫原性，为针对高变异性病原体（如肺炎克雷伯菌）的疫苗设计提供了新思路。
引言
糖缀合物是迄今为止开发的最安全、最有效的多糖（PS）疫苗之一。将多糖与适当的蛋白质偶联可以克服多糖T非依赖性抗原的局限性，在婴幼儿和老年人中提供长期免疫记忆。目前许可的糖缀合物疫苗使用相同的少量载体蛋白（白喉类毒素、破伤风类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌D蛋白；以及脑膜炎球菌B的外膜蛋白复合物），引发了对预先或共同暴露于相同载体可能导致抗碳水化合物免疫反应降低的担忧。这种所谓的载体诱导表位抑制现象的风险凸显了对新载体蛋白的需求。在此背景下，探索使用病原体特异性蛋白同时作为载体和抗原以产生"双重打击"疫苗的可能性引起了越来越多的兴趣。因此，可能需要选择性偶联化学，以对蛋白质结构和构象产生有限影响，同时注意要偶联的聚糖的程度和位置。
除了直接化学修饰策略（其在选择性/特异性以及反应均一性方面仍存在一些缺点）之外，基因工程已被证明是一种宝贵的方法，可在指定位点可控地引入各种非生物和生物化学手柄，用于随后的生物正交反应，从而产生均一的、选择性的结合物。特别是，细菌糖工程已成为位点选择性蛋白质修饰的强大工具。蛋白质糖基化系统也存在于细菌领域的发现为蛋白质-聚糖偶联技术（PGCT）或生物偶联的发展铺平了道路，可直接在细菌宿主内生产糖缀合物疫苗。最近开发的PGCT衍生糖缀合物疫苗采用了"双重打击"策略，这对于具有多种不同聚糖结构的细菌物种（如肺炎球菌）可能特别有用。
一种更近发现的糖基化机制，最初在变形菌门流感嗜血杆菌中鉴定出来，依赖于在细菌细胞质（通常用于高效重组蛋白表达的细胞区室）中操作的N-糖基转移酶（NGT）。最近，描述了一种在大肠杆菌细胞质中利用NGT安装引发β-葡萄糖，从而实现重组蛋白质位点特异性多唾液酸化的生物合成途径。通过添加一系列适当的酶，作者不仅能够实现NGT天然底物的多唾液酸化，还能实现异源蛋白质（如超级文件夹绿色荧光蛋白（sfGFP）或设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin））的多唾液酸化。该技术平台也已扩展到自组装蛋白质，用于在大肠杆菌细胞质中生产具有未来多种生物医学应用的糖基化兆道尔顿级纳米颗粒。NGT催化的N-糖基化作为用葡萄糖对蛋白质进行位点特异性修饰的工具，其潜力为许多有趣的应用奠定了基础。
在本研究中，我们研究了该技术用于开发新型选择性"双重打击"糖缀合物，目的是以肺炎克雷伯菌（Kp）为模型病原体，保留所选载体蛋白的抗原性。Kp已被世卫组织列为需要新干预措施的优先多重耐药病原体，它是大多数医院感染和低收入和中等收入国家新生儿败血症的病原体，目前尚无疫苗可用。
流行病学研究提高了人们的认识，即能够覆盖约70%临床相关Kp菌株的Kp疫苗应至少包含25种荚膜多糖，也称为K抗原（KAg）。其中，K1和K2常见于高毒力Kp菌株。O抗原（OAg）的数量远少于KAg，预计其中仅四种（O1、O2、O3和O5）可覆盖超过80%的临床相关Kp菌株。最近，提出了结合KAg和OAg的疫苗。
本文中，KAg和脂多糖OAg均被用于生成"双重打击"疫苗，使用MrkA作为载体和潜在的保护性蛋白抗原。特别是，选择O1v1多聚半乳糖和K2分别作为模型OAg和KAg。MrkA是Kp3型菌毛的主要成分，在不同分离株中具有高度的序列保守性，因此其在糖缀合物中的使用可以增加疫苗的覆盖率，考虑到已描述的Kp多糖数量众多。此外，已有临床前数据表明，用纯化的菌毛免疫能够在急性肺炎模型中保护小鼠免受致命攻击，并且皮下接种单体低聚MrkA的小鼠在鼻内攻击Kp后细菌载量减少。
结果与讨论
自补足MrkA单体用于细胞质糖工程
MrkA天然形成低聚体，其稳定性与蛋白质C端区域的分子间β折叠相关，这是与每个后续亚基的N端供体链相互作用的结果。为了获得自补足的MrkA单体，采用了先前描述的供体链置换策略。在阿拉伯糖诱导型启动子控制下，在大肠杆菌中表达重组MrkA单体，获得了良好的纯化蛋白产量（约60 mg L-1）。蛋白质糖基化的生物合成途径是在大肠杆菌K12 W3110菌株中建立的，该菌株删除了lacZ基因以防止乳糖分解代谢，这证实了先前发表的结果。该途径包括第一种酶，来自胸膜肺炎放线杆菌的ApNGT，用于在NGT识别的NXS/T序列（其中X不是P）的目标天冬酰胺（Asn, N）残基处用单个β-连接的葡萄糖修饰蛋白质。为了生成N-连接的乳糖，使用了来自脑膜炎奈瑟菌的β1,4-半乳糖基转移酶LgtB，该酶已被证明具有底物混杂性并能在大肠杆菌中活跃表达，用于将半乳糖从相应的核苷酸活化糖转移至Glcβ1-Asn手柄。这两种酶被克隆到一个相容的质粒载体中，每种都在IPTG诱导的LacUV5启动子（lac启动子的突变变体）控制下，以实现蛋白质和酶的共表达。这种双质粒表达系统应能确保底物蛋白质和糖基转移酶合成之间的良好平衡。
出于我们的目的，将带有插入N端的N-A-T序列的MrkA与ApNGT和LgtB酶或仅与ApNGT在大肠杆菌K-12衍生的ΔlacZ菌株中共表达。实际上，产生了一个截短的途径构建体，以跟踪顺序的MrkA修饰，并评估哪种类型的糖手柄能更好地用于后续的选择性偶联策略。与未修饰的MrkA一样，Glyco-MrkA重组蛋白获得了良好的产量（约70 mg L-1）和纯度。在蛋白质凝胶中，可以观察到Lac-MrkA条带向更高分子量有轻微移动，这很可能表明发生了修饰。采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD）对不同糖蛋白酸解释放后的单糖（Glc和Gal）量进行定量，通过计算糖单体与蛋白质的摩尔比来确定糖基化水平。虽然所有分析批次中Glc-MrkA的葡萄糖基化几乎完全，但乳糖占据率最初较低。有趣的是，使用含有葡萄糖代替甘油作为碳源的不同生长培养基，可以显著提高Lac-MrkA的乳糖基化水平。
成功的MrkA糖基化还通过完整质量分析（ESI-MS）和胰蛋白酶消化后的肽质量指纹图谱（LC-MS/MS）得到证实。出乎意料的是，通过LC-MS/MS鉴定的被Glc或Lac修饰的肽段并非特意添加到MrkA N端的那个（在图1a中以红色突出显示）。相反，在MrkA天然存在于溶剂暴露环中的另一个NGT序列（在图1a中以蓝绿色突出显示）的天冬酰胺残基被证明在Glc-MrkA或Lac-MrkA中分别被Glc或Lac修饰。
利用Lac-MrkA生成位点选择性双重打击糖缀合物
Glyco-MrkA被用于开发一种旨在保留MrkA免疫原性的选择性偶联方法。重组MrkA单体上存在的独特糖柄被用作通过还原胺化进行Kp多糖（包括OAg和KAg）位点选择性偶联的特异性靶点。对两种MrkA糖型进行了初步测试，以选择糖氧化的最佳条件，因为它直接影响偶联效率。在较高NaIO4浓度（5 mM）下，氧化水平增加。有趣的是，半乳糖更容易被氧化，这很可能是因为邻位顺式二醇优先裂解，与葡萄糖的反式二醇相比，更容易形成环状高碘酸盐中间体。因此，选择乳糖糖型用于生成选择性结合物，因为在Glc-MrkA中约50%的糖被氧化时，实际上只有一半的MrkA分子可用于偶联。
纯化的O1v1 OAg和K2 KAg用氰化剂（CDAP）随机活化，并用醛反应性同双功能接头ADH进行衍生化，如先前报道。为了便于蛋白质偶联，通过超声处理将约340 kDa的K2尺寸减小至约160 kDa，这降低了溶液粘度。尺寸减小后的K2的活化百分比与天然形式相当。
整个偶联策略如图3a所示。通过SDS-PAGE/WB和HPLC-SEC分析O1v1-ADH与未修饰MrkA的空白反应，证实了该反应的位点选择性，证明没有结合物形成。
O1v1结合物在IMAC纯化步骤的洗脱池中完全回收，而K2结合物的回收率较低（70%），可能是由于在具有像K2这样长多糖的结合物中，His标签对Ni2+离子的可及性降低。通过HPLC-SEC分析，两种结合物相对于MrkA蛋白质的保留时间较低，表明由于PS偶联导致尺寸增加。通过HPAEC-PAD结合微BCA，确定了MrkA和PS之间的摩尔比：平均每个O1v1 OAg链连接了约3个MrkA分子，最终纯化结合物的WB分析也突出了这一点；而每个K2 KAg链连接了约20个MrkA分子。
针对Kp的位点选择性双重打击糖缀合物的免疫原性
对O1v1-MrkA和K2-MrkA结合物在小鼠中进行了测试，以研究MrkA作为Kp PS载体和抗原的能力，并评估偶联对MrkA免疫反应的影响。小鼠在Alhydrogel存在下，以相同的MrkA剂量5 μg皮下免疫两次（第0天和第28天）。为了验证选择性偶联反应所需的氧化步骤是否会影响MrkA的免疫原性，Lac-MrkA也被氧化并在动物中进行了测试。作为阴性对照，在免疫方案中包括了K2与MrkA的物理混合物。当与MrkA偶联时，K2诱导的抗K2特异性IgG滴度水平显著高于两种抗原的物理混合物。相反，O1v1-MrkA结合物未能引发任何抗O1v1特异性IgG抗体。这可能是因为该结合物尺寸较小，由平均3个MrkA分子选择性地连接到较短的O1v1糖上，这可能不是免疫刺激的最合适形式。糖的长度和尺寸以及结合物的大分子/多分子结构可能在产生良好的抗PS IgG反应中发挥重要作用。Lac-MrkA的氧化对抗蛋白质免疫反应没有任何影响，因为比较MrkA和氧化的Lac-MrkA的IgG反应在第27天和第42天均未观察到差异。两种选择性糖缀合物诱导的抗MrkA IgG反应与单独MrkA相比无显著差异，证实偶联不影响MrkA的免疫原性。值得注意的是，除K2-MrkA结合物组外，所有组中均存在大量无应答者。在第42天，K2-MrkA结合物组的几何平均值比MrkA组高14倍。似乎MrkA作为PS载体的能力与最终糖缀合物的分子质量成正比。实际上，K2-MrkA结合物能够诱导良好水平的抗PS IgG抗体，这些抗体对Kp K2:O1v1菌株也具有杀菌活性，这与OAg结合物相反。重要的是，MrkA与PS的选择性偶联并未对蛋白质引发的免疫反应产生负面影响。实际上，将多个蛋白质与长K2链偶联导致抗MrkA的IgG反应略有改善，通过流式细胞术测试抗MrkA抗体与具有错配OAg和KAg的野生型Kp菌株的结合能力证实了这一点。
K2-MrkA结合物也在兔子中进行了测试。同样在这种动物模型中，在Alhydrogel存在下，以相同的蛋白质剂量15 μg比较糖缀合物和单独MrkA，K2-MrkA结合物引发了良好的抗MrkA IgG水平，与单独MrkA诱导的水平无显著差异。因此，MrkA在与K2连接时作为载体和病原体特异性抗原的能力也在不同动物物种中得到证实。
细胞质糖工程的进一步探索
通过LC-MS/MS发现Lac修饰发生在MrkA氨基酸序列中天然存在的序列水平，而不是添加在蛋白质序列N端的那个序列上，因此设计了不同的MrkA版本来更好地表征糖基转移酶的活性。这有助于探索偶联位点是否会影响结合物的免疫原性和蛋白质的抗原性。为了降低系统的复杂性，仅研究了NGT的活性，已知葡萄糖修饰是完全且一致的。设计并生产了三个额外的MrkA构建体，将天然序列中被糖基化的Asn突变为Gly，并在MrkA序列的不同位置设计NGT序列作为GlycoTags。通过LC-MS/MS进行肽质量指纹分析以获得修饰位点的信息。数据显示，每个构建体中参与糖基化的残基都是预期的Asn。值得注意的是，只有当我们将序列定位在MrkA的N端时，预期的修饰没有发生。这很可能是因为该区域固有的无序性。此外，据报道，与N-糖蛋白的中部区域相比，N-糖基化发生在蛋白质序列末端的可能性较小。与LC-MS/MS一致，HPAEC-PAD分析证实所有三个构建体中的Glc修饰均为100%，与先前描述的Glc-MrkA相比。最后，还设计了第五个MrkA版本，携带多达四个NGT序列。HPAEC-PAD分析显示Glc与蛋白质的摩尔比约为4，意味着每个序列的修饰率接近100%。
结论
在这项工作中，我们开发了一种基于细胞质蛋白质糖工程的新型选择性偶联策略，测试了Kp 3型菌毛MrkA作为蛋白质载体和抗原。MrkA作为一个潜在的疫苗靶点引起了强烈兴趣，因为它由大多数Kp菌株表达，包括高毒力Kp。在巴斯德研究所数据库（约40,000个基因组）中，约95%的Kp分离株中存在MrkA，其序列同源性高于85%，因此，对于像Kp这样具有大多糖变异性的细菌物种，"双重打击"方法（即PS和载体蛋白均来自同一病原体）可能非常有助于提高疫苗覆盖率。
细胞质糖工程成功应用于用葡萄糖和乳糖修饰MrkA。乳糖糖型比Glc-MrkA更容易被氧化，因此氧化的Lac-MrkA被用于与随机ADH衍生的PS进行还原胺化反应。这种选择性偶联反应导致形成的糖缀合物具有通过其单一附着点连接到PS链上的多个蛋白质分子，这与生物结合物（其中一个蛋白质携带少量聚糖链）不同。总体而言，MrkA作为PS载体的能力似乎与最终糖缀合物的分子质量成正比。实际上，K2-MrkA结合物能够诱导良好水平的抗PS IgG抗体，这些抗体对Kp K2:O1v1菌株也具有杀菌活性，而OAg结合物则不能。重要的是，MrkA与PS的选择性偶联并未对蛋白质引发的免疫反应产生负面影响。实际上，将多个蛋白质与长K2链偶联导致抗MrkA的IgG反应略有改善，通过测试诱导的抗MrkA抗体与具有错配OAg和KAg的野生型Kp菌株的结合能力（通过流式细胞术）得到证实。
这项工作的主要局限性在于MrkA的功能表位仍然未知，因此我们不知道在何处修饰MrkA可能更合适而不影响血清功能性。虽然已经建立了测量抗MrkA单克隆抗体效力的既定功能测定法，包括生物膜抑制测定和吞噬杀伤（OPK）测定，但它们应用于动物血清仍然具有挑战性，因此难以确定糖基化对MrkA抗原性的实际影响。尽管如此，我们已经证明NGT序列可以容易地在蛋白质的不同位点进行工程化改造，这支持了进一步的研究，以了解糖基化位置是否会影响所得选择性结合物的免疫原性。根据小鼠研究中O1v1-MrkA结合物的结果，对于像这样的短PS，可能需要一个以上的序列来诱导良好的抗PS免疫反应。O1v1-MrkA结合物的低免疫原性可能与小的蛋白质抗原（如MrkA）通过单一附着点连接到短糖链上载体功能较差有关。有趣的是，MAPS技术也获得了相同的结果，该技术具有相同的最终糖-蛋白质呈现方式。对于短寡糖，很可能需要更高的聚糖负载于蛋白质上才能产生最佳的免疫反应。实际上，文献中报道的其他方法成功诱导了显著的抗OAg IgG反应。总之，我们成功地将细菌细胞质糖工程和选择性偶联化学相结合，用于开发Kp双重打击疫苗。这里开发的方法可以扩展到其他病原体，用于合成创新性糖缀合物，选择性地将长链PS与蛋白质连接，后者具有载体和抗原的双重作用。
