OvHMA3通过促进根部的主动运输来增强Onobrychis viciifolia（一种植物）对镉的耐受性，从而实现根部分区化

《Journal of Hazardous Materials》：OvHMA3 enhances cadmium tolerance in Onobrychis viciifolia by promoting root compartmentalization via active transport

紫花苜蓿通过OvHMA3基因介导的液泡隔域化机制增强镉耐受，其ATP依赖的转运功能有效降低茎叶中镉积累并减少氧化损伤。

　　

刘曼|王子月|尹淑霞

北京林业大学草原科学学院，北京，100083，中国

摘要

镉（Cd）污染对农业安全和生态系统健康构成了严重威胁。Onobrychis viciifolia是一种有前景的植物修复候选物种，但其耐镉的分子机制仍不清楚。在镉胁迫下，该物种表现出在根组织中强化的镉积累能力，这体现在其极低的转移因子上。RNA-seq分析显示，镉胁迫显著诱导了与重金属转运相关的基因表达，尤其是编码重金属ATP酶（HMAs）的基因。通过全基因组鉴定和表达分析，我们确定了OvHMA3作为关键候选基因，其在镉作用下以浓度依赖性方式显著上调。我们确认了OvHMA3定位于液泡膜上。在酵母和拟南芥中异源过表达OvHMA3显著提高了其对镉的耐受性。机制研究表明，OvHMA3作为P型ATP酶，介导了依赖ATP的镉离子向液泡的转运。这一过程导致根部的镉积累量增加（根与茎的比例约为5.31），并显著减少了转基因植物的叶片氧化损伤。我们的发现阐明了O. viciifolia通过OvHMA3

引言

镉（Cd）是一种高毒性的重金属，由于其在土壤中的广泛分布，已成为严重的全球环境问题[1]。镉的主要人为来源包括电镀废水、镍-镉电池的处理以及矿山尾矿的渗漏[2]。镉离子的高移动性和持久性使其容易被植物根部吸收，从而进入食物链并在人体器官（如肝脏和肾脏）中不可逆地积累。除了对人类健康的影响外，植物对镉的吸收还会干扰重要的生理过程，包括水分代谢和生长，并通过改变土壤微生物群落和养分循环威胁生态系统稳定性[3],[4],[5]。植物修复是一种有前景的重金属污染控制策略，它利用植物吸收、积累和转化污染物，并通过根际相互作用得到支持。这种方法具有成本效益高、环境友好和可持续性[6],[7]。然而，植物修复的应用面临两个关键限制：首先，高生物量植物物种的金属积累能力通常有限；其次，虽然超积累植物能有效浓缩金属，但它们通常生物量低且生长缓慢。此外，它们倾向于将重金属转移到地上部分，从而增加二次污染的风险[8],[9],[10]。

Onobrychis viciifolia是一种具有显著生态和饲草价值的豆科植物，使其成为植物修复的理想候选物种。其快速生长能力和高效的共生固氮系统使其能够在短时间内形成密集的根系和冠层覆盖[12],[13],[14]。研究表明，O. viciifolia对重金属具有显著的耐受性[15],[16],[17]。此外，它能够在极端环境中（如pH 3.8–5.2的酸性矿区）完成生命周期，并在多重重金属污染的情况下促进植被恢复[18]。重要的是，它可以显著限制有毒重金属的转移（将茎部的铅和镍积累量减少72-79%），从而产生更安全的生物质[17]。这些综合特性，特别是其高生物量与低重金属转移效率的结合，使O. viciifolia成为理想的修复系统。值得注意的是，镉由于其高移动性和对植物和动物的急性毒性，是农业和自然生态系统中最具危害性的污染物之一。该植物固有的限制重金属向上转移的能力（如铅和镍的情况所示）表明，它可能是一种有效的镉去除策略。然而，其对这种高移动性和高毒性金属的具体响应机制仍不甚清楚。此外，目前的研究主要是表型水平的，缺乏对其重金属耐受性分子机制的系统性分析，特别是关键基因家族的功能作用。因此，阐明其应激响应的遗传基础对于提高其修复效率至关重要。

植物进化出了一套复杂的调控网络来吸收和转运镉，这些网络由多种金属转运蛋白家族协调[19]。其中，重金属ATP酶（P?B-ATP酶或HMAs）在依赖ATP水解的主动跨膜转运中起核心作用，对植物的金属稳态和解毒至关重要[20]。根据底物特异性和系统发育关系，这一家族被分为Cu/Ag-转运亚组和Zn/Co/Cd/Pb-转运亚组，后者对重金属解毒尤为重要[21]。在模式植物中的功能研究表明，特定HMAs的关键作用。例如，在拟南芥中的AtHMA3是一种定位于液泡膜的转运蛋白，通过将镉、锌和铅隔离到液泡中来增强其对这些金属的耐受性[22]。同样，在水稻（Oryza sativa）中，OsHMA3在根液泡中起作用，将根部的镉转移减少10倍，并将籽粒中的镉积累减少96%[23]。此外，来自Sedum alfredii的SaHMA3h的异源表达通过同时提高镉耐受性和积累能力，增强了烟草（Nicotiana tabacum）的植物修复潜力[24]。超积累植物Sedum plumbizincicola进化出了独特的解毒策略；特别是其SpHMA3获得了特定的镉转运活性，实现了高效的解毒[25]。其定位于叶绿体中的SpHMA1通过调节镉的外排帮助维持光合作用稳定性[26]，而在拟南芥中异源表达SpHMA2证实了其同时提高镉耐受性和茎部镉积累的能力[27]。这些发现共同强调了HMA家族在植物重金属稳态中的关键作用。然而，这一家族在豆科饲草作物中的功能及其调控机制，特别是在多倍体物种O. viciifolia中的机制，仍有待系统阐明。

因此，为了揭示O. viciifolia中镉解毒的分子基础，本研究重点关注了重金属转运系统中的关键功能基因，特别是HMA家族。鉴于其自四倍体基因组的复杂性，研究目标包括：（1）首次在全基因组范围内鉴定O. viciifolia中的HMA基因家族；（2）通过转录组分析和表达验证确定核心的镉响应HMA基因；（3）使用异源表达系统功能表征关键基因OvHMA3在镉耐受性和隔离中的作用。这项研究为这种饲草豆科植物中保守但增强的镉解毒机制提供了新的见解，并为开发植物修复策略和培育更安全的作物提供了宝贵的遗传资源。

实验部分

植物生长条件和镉处理

选择了紫花苜蓿种子，并用75%乙醇进行表面灭菌30秒，然后浸入1%次氯酸钠溶液中20分钟并轻轻搅拌。随后，用无菌去离子水冲洗3-5次，转移到25°C的恒温培养箱中进行黑暗条件下发芽。

培养7天后，选择了根长为5.4 ± 0.68厘米的均匀幼苗进行实验。盆栽试验在

植物生长及叶片和根部中的镉积累与分布

与对照组相比，不同浓度的镉处理显著影响了幼苗的茎长、根长和每株植物的生物量（见图1A、B）。在10 μmol/kg的镉处理下，茎长、根长和每株植物的生物量均显著增加（p < 0.05）。然而，在50、100和250 μmol/kg的镉处理下，茎长分别减少了2.51%、11.98%和22.47%；根长分别减少了2.82%、3.53%和5.48%

讨论

由于镉的高生物毒性、持久性和在食物链中的生物累积潜力，土壤镉污染已成为全球农业生态安全和人类健康的主要威胁[42]。具有独特共生固氮能力、高生物量积累和应激适应性的豆科饲草植物O. viciifolia，在修复退化土壤和利用边际土地方面显示出巨大潜力[43]。

结论

紫花苜蓿虽然不是镉的超积累植物，但由于其根部的储存策略，表现出异常的镉耐受性。液泡膜定位的转运蛋白OvHMA3在镉胁迫下被特异性诱导。在酵母和拟南芥中的异源过表达实验证实，OvHMA3显著增强了宿主的镉耐受性。其分子机制涉及OvHMA3作为“分子泵”，利用ATP水解的能量主动将细胞质中的镉离子转运并隔离到

环境影响

镉是一种危险物质，因其高毒性、持久性和在食物链中的积累倾向而备受关注。植物修复常常面临低生物量超积累植物和高生物量植物之间的权衡问题，后者可能通过茎部转移镉而导致二次污染。本研究将紫花苜蓿确定为一种有前景的“高生物量、低转移”替代方案。其关键机制是通过液泡转运蛋白OvHMA3

伦理批准和参与同意

不适用

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

出版同意

不适用。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号32371764）的支持。

CRediT作者贡献声明

尹淑霞：撰写 – 审稿与编辑，监督。王子月：撰写 – 审稿与编辑，方法学。刘曼：撰写 – 初稿，可视化，方法学，数据分析，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。