《Materials Today Bio》：Bioinspired Lipid Droplets Nanoplatform for Periodontitis Therapy: Integrated Antibacterial, Mitochondrial Repair, and Immunomodulatory Functions
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本研究针对牙周炎多重病理机制（菌群失调、氧化应激及免疫紊乱）的协同干预难题，开发了一种基于巨噬细胞源脂滴（LDs）的仿生纳米平台（GA@LDs-CRAMP）。该平台通过LPS刺激原位锚定抗菌肽CRAMP，并封装藤黄酸（GA）于疏水核心，实现了抗菌、线粒体靶向修复及巨噬细胞M1/M2表型重编程的多功能协同。实验表明，该纳米系统可有效清除牙周病原体（如Aa/Pg）、清除ROS修复线粒体功能，并通过激活Nrf2/HO-1通路抑制NF-κB炎症级联。动物实验证实其能显著缓解牙槽骨吸收，为牙周炎精准治疗提供了新策略。
牙周炎作为一种常见的慢性炎症性疾病，已成为成年人牙齿丧失的主要原因。这一疾病不仅局限于口腔健康问题，更被证实是多种全身性疾病（如心血管疾病、糖尿病等）的独立危险因素。当前研究认为，牙周炎的发病机制涉及口腔微生物群失调、宿主免疫反应过度激活以及氧化应激等多重因素相互交织，形成复杂的病理网络。其中，持续炎症状态导致活性氧（ROS）过度产生，加剧巨噬细胞M1型极化，引发炎症因子风暴，同时伴随线粒体功能障碍，共同推动牙周组织不可逆损伤。面对这一复杂局面，传统单一靶点治疗策略往往难以奏效，亟需开发能够同时干预多个病理环节的新型治疗手段。
在这一背景下，仿生纳米技术为牙周炎治疗带来了新的希望。近期研究表明，细胞内的天然细胞器可作为理想的药物递送载体，其中脂滴（LDs）因其独特的结构和功能特性备受关注。脂滴是由磷脂单层包裹中性脂质核心形成的细胞器，能够高效负载疏水性药物，并具备天然靶向性和低免疫原性等优势。尤其有趣的是，当巨噬细胞受到脂多糖（LPS）刺激时，其脂滴表面会特异性招募抗菌肽CRAMP，赋予这些天然细胞器内在的抗菌能力。这一发现为设计兼具抗菌和抗炎功能的多功能纳米平台提供了重要灵感。
本研究发表于《Materials Today Bio》，旨在开发一种基于巨噬细胞源脂滴的仿生纳米平台（GA@LDs-CRAMP），通过整合抗菌、抗氧化和免疫调节功能，实现对牙周炎多重病理机制的协同干预。研究人员巧妙利用RAW264.7巨噬细胞来源的脂滴作为药物载体，在其疏水核心封装具有抗氧化和抗炎活性的藤黄酸（GA），同时通过LPS刺激在脂滴表面原位锚定抗菌肽CRAMP，构建了一种具有时空协调功能的新型纳米治疗系统。
为开展这项研究，团队采用了多项关键技术方法。他们首先通过细胞培养技术获取RAW264.7巨噬细胞、小鼠牙龈成纤维细胞（MGFs）和骨髓源性巨噬细胞（BMDMs），并建立了小鼠牙周炎模型。纳米平台的构建涉及油酸（OA）诱导脂滴生物合成、GA被动装载和LPS刺激CRAMP招募的序贯处理流程。表征手段包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和紫外-可见光谱（UV-Vis）等理化性质分析。功能评估涵盖体外抗菌实验、细胞摄取与亚细胞分布观察、ROS清除能力检测、线粒体膜电位（MMP）和形态学分析。分子机制研究采用qRT-PCR、Western Blot、RNA测序（RNA-seq）和免疫荧光等技术，全面解析了纳米平台的作用通路。动物实验通过微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学染色评估治疗效果，样本来源于C57BL/6小鼠。
3.1. GA@LDs-CRAMP纳米级细胞器平台的生物工程学构建与表征
研究人员通过合理的策略建立了RAW264.7巨噬细胞衍生的脂滴作为工程化药物载体：首先应用OA刺激促进脂滴生物合成，随后将疏水性化合物GA被动封装到中性脂质核心中。通过共聚焦显微镜观察，Cy5.5标记的GA与脂滴特异性荧光信号之间存在显著共定位，证实了GA成功递送到脂滴中。LPS刺激（1μg mL-1，18小时）协同增强了脂滴生物合成，导致脂滴数量和尺寸增加。免疫荧光测定显示，在LPS激活的RAW264.7巨噬细胞中，CRAMP定位于脂滴表面，而在未刺激的对照组中CRAMP信号可忽略不计。通过高速离心成功分离出细胞内工程化的GA@LDs-CRAMP，形成特征性的白色界面层。冷冻干燥后，颗粒表现出优异的水分散性。TEM分析证实了分离后LDs-CRAMP和GA@LDs-CRAMP的结构保持，显示出单分散的球形形态，平均直径分别为327.3±23.9 nm和172.9±5.1 nm。GA@LDs-CRAMP表现出pH响应性释放特性，在模拟牙周炎症微环境的酸性条件（pH 5.5）下，GA在24-72小时内持续释放。稳定性评估表明，在生理条件和体外条件下，GA@LDs-CRAMP在PBS和10% FBS-DMEM中72小时内尺寸变化可忽略不计，表现出 exceptional 的胶体稳定性。
3.2. 双功能脂滴实现抗菌和线粒体靶向递送
功能分析表明，分离的LDs-CRAMP显著抑制了牙周炎相关病原体Aa和Pg的生长，平板培养物上菌落形成单位（CFU）显著减少，液体悬浮液中的OD600值显著降低。GA@LDs-CRAMP的抗菌活性也受合成过程中LPS浓度和脂滴数量的影响，进一步证实了其表面CRAMP蛋白生产的优异可控性。细胞毒性评估显示，GA@LDs-CRAMP在浓度≤250nM时对MGFs的细胞毒性可忽略不计，而在BMDMs中浓度高达500nM时仍保持>90%的细胞活力。利用脂滴天然细胞器穿越生物屏障的内在运输能力，GA@LDs-CRAMP在12小时内促进快速细胞摄取。共聚焦成像与细胞器特异性探针证实了GA@LDs-CRAMP主要定位于线粒体附近，根据Pearson系数，从而实现了线粒体定向药物递送。
3.3. GA@LDs-CRAMP在氧化应激下对线粒体的修复作用
使用ROS敏感性荧光探针DCFH-DA，研究人员证明GA@LDs-CRAMP有效减轻了H2O2诱导的MGFs中ROS过度产生。JC-1染色显示，H2O2诱导的MMP降低与处理细胞中糖酵解上调相关。GA@LDs-CRAMP处理显著增强了红色荧光强度，促进了线粒体网络完整性的部分恢复，并提高了J-聚集体/单体比率，证实了MMP恢复。MitoTracker-Red染色揭示了H2O2处理的MGFs中严重的线粒体断裂、核周聚集和细胞质分布破坏。值得注意的是，GA@LDs-CRAMP处理逆转了这些病理特征，恢复了管状线粒体形态和均匀的细胞质分布，其结构修复效果优于游离GA。CCK-8测定表明，GA@LDs-CRAMP预处理将MGFs从H2O2诱导的细胞毒性中拯救出来，增加了细胞活力。RNA测序（RNA-seq）分析表明，与H2O2处理的对照组相比，GA@LDs-CRAMP处理诱导了3,312个上调基因和4,998个下调基因的差异表达。显著上调的基因包括线粒体复合物I亚基（mt-Nd1, mt-Nd2, mt-Nd3, mt-Nd4, mt-Nd6, mt-Atp6）和ETC细胞色素相关基因（mt-Co2, mt-Co3, mt-Cytb）。基因集富集分析（GSEA）进一步验证了这些观察结果，显示GA@LDs-CRAMP处理后ETC相关和氧化磷酸化相关基因集显著上调。
3.4. GA@LDs-CRAMP通过Nrf2/NF-κB信号双调节和巨噬细胞M2极化实现炎症消退
在LPS刺激的BMDMs中，GA@LDs-CRAMP预处理显著抑制了NF-κB介导的Il6和肿瘤坏死因子（Tnf）-α的转录激活。同时，GA@LDs-CRAMP下调M1极化标志物诱导型一氧化氮合酶（Nos2），而上调M2标志物精氨酸酶1（Arg1）和抗炎细胞因子Il10，证实巨噬细胞向组织修复性M2表型重编程。ELISA试剂盒检测细胞培养上清液进一步证实，GA@LDs-CRAMP预处理显著降低了LPS诱导的炎症细胞因子IL-6水平，并显著提高了抗炎细胞因子IL-10水平，效果优于单独游离GA。流式细胞术分析F4/80标记的BMDMs极化显示，GA@LDs-CRAMP显著减少了LPS诱导的CD86标记的M1型巨噬细胞数量，并将其极化为CD206标记的M2型巨噬细胞。RNA-seq分析显示，GA@LDs-CRAMP处理与LPS处理的BMDMs之间存在深刻的转录组重编程。差异表达基因（DEGs）分析在GA@LDs-CRAMP处理与LPS处理的BMDMs中鉴定出1,377个上调基因和1,892个下调基因。KEGG通路富集分析确定NF-κB信号是最显著改变的通路。GA@LDs-CRAMP显著促进了Nrf2的核积累，同时显著降低了胞质Keap1的表达，从而与LPS刺激的对照组相比，显著上调了下游效应因子HO-1和NQO1。Western印迹和半定量分析验证了这些转录变化在蛋白质水平上的表现。GA@LDs-CRAMP治疗通过减弱磷酸化NF-κB p65（p-p65）和抑制IκBα磷酸化（p-IκBα）来抑制NF-κB信号传导。
3.5. GA@LDs-CRAMP对小鼠实验性牙周炎的综合治疗作用
通过上颌第二磨牙结扎7天诱导牙周炎症，随后在15天的治疗期内每3天局部注射GA@LDs-CRAMP、LDs-CRAMP或游离GA（总共5次剂量）。Micro-CT分析证实，牙周炎组釉质牙骨质界（CEJ）到牙槽骨嵴（ABC）的距离显著增加，验证了疾病诱导成功。GA@LDs-CRAMP治疗显著恢复了牙槽骨高度，与疾病对照组相比降低了CEJ-B和CEJ-P距离，疗效优于LDs-CRAMP或游离GA单药治疗。小梁结构的定量micro-CT分析证实了治疗效果：GA@LDs-CRAMP逆转了牙周炎诱导的骨体积分数（BV/TV）、骨矿物密度（BMD）和小梁数量（Tb.N）的降低，同时恢复了小梁分离度（Tb.Sp）。H&E染色显示，GA@LDs-CRAMP给药逆转了这些破坏性改变，恢复了接近天然的牙周细胞结构。Masson三色染色进一步突出了治疗结果。GA@LDs-CRAMP治疗恢复了胶原结构的完整性，显示出重新组织的纤维排列和与未经治疗的牙周炎对照组相比减少的基质碎片。牙周组织的免疫组织化学（IHC）分析表明炎症反应受到显著调节。牙周炎组在上皮下软组织中表现出显著的IL-6表达，GA@LDs-CRAMP治疗显著减弱了这种表达。此外，GA@LDs-CRAMP给药增强了Arg1的表达，同时抑制了iNOS，与先前体外研究中观察到的免疫调节效应一致。牙周组织的免疫荧光分析显示，组织切片中的巨噬细胞极化也受到显著调节：F4/80免疫荧光标记巨噬细胞后，牙周炎组CD86标记的M1型巨噬细胞数量显著增加，而GA@LDs-CRAMP治疗组显著减少，甚至低于LDs-CRAMP治疗组和GA治疗组。此外，GA@LDs-CRAMP治疗显著增加了CD206标记的M2型巨噬细胞数量，高于LDs-CRAMP治疗组和GA治疗组。通过主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色进行全身生物安全性评估显示，所有实验组均保持组织结构完整性，GA@LDs-CRAMP治疗的动物中未检测到病理改变。
研究结论与讨论部分强调了该仿生纳米平台的综合优势。脂滴凭借其独特的结构和功能特性，成为理想的药物递送载体。与合成脂质纳米颗粒（LNPs）相比，天然来源的药物载体（如细胞、细胞器）表现出更好的生物相容性、更低的免疫原性和往往更优的靶向能力。脂滴与线粒体之间存在密切的功能关系，分离后的脂滴仍保留与线粒体相互作用等关键生理功能。本研究证实，GA@LDs-CRAMP在高效细胞摄取后，与溶酶体和内质网相比，更集中地分布在线粒体周围。
抗菌肽CRAMP依靠其两亲性α-螺旋结构和净正电荷发挥抗菌活性，通过经典抗菌机制对牙周病原体Aa和Pg产生显著抑制作用。CRAMP在脂滴表面的稳定锚定和可控表达进一步确保了抗菌效应的特异性和可持续性。
藤黄酸（GA）在适当浓度下表现出抗炎和抗氧化作用，脂滴作为载体有效解决了疏水性GA生物利用度低的问题。脂滴的天然细胞来源实现了更高效、稳定的细胞识别，且保存的线粒体靶向能力即使提取后仍能促进GA递送至线粒体周围，更有效地修复氧化应激损伤的线粒体。
脂滴在炎症反应中是动态变化的细胞器，代表细胞对炎症刺激自我调节的一种形式。本研究利用脂滴在炎症后期的抗炎能力，结合GA的抗炎特性，在缓解RAW264.7细胞炎症状态的同时，实现了脂滴表面抗菌肽CRAMP的招募。
Nrf2/NF-κB通路协同调节抗氧化和抗炎反应。研究表明，GA@LDs-CRAMP激活Nrf2通路，从而抑制NF-κB信号传导，促进巨噬细胞从M1向M2表型转变，最终发挥抗氧化和抗炎作用。
针对牙周炎这一细菌诱导的慢性炎症性疾病，GA@LDs-CRAMP在设计上具备在牙周炎复杂细菌和炎症微环境中相当大的治疗潜力。动物实验证实，局部注射GA@LDs-CRAMP可显著缓解小鼠牙周炎，在软组织水平减轻牙龈肿胀，在牙间和根间水平恢复牙槽骨高度。
该研究成功开发了一种基于巨噬细胞源脂滴的仿生纳米平台（GA@LDs-CRAMP），通过模拟内源性免疫防御机制，实现了线粒体靶向递送GA以通过ROS清除和线粒体修复减轻牙龈成纤维细胞的氧化应激，同时CRAMP肽功能化赋予了对牙周病原体的有效抗菌活性。该纳米治疗系统源自激活巨噬细胞的内源性成分，确保了生物安全性和疾病部位保留，为治疗复杂炎症性疾病引入了免疫启发纳米技术的新策略，实现了可轻松应用于临床的精确、局部治疗，同时最大限度地减少了全身副作用。
