RNF6通过促进K48标记的NME4蛋白的泛素化，激活卵巢癌中的JNK/c-JUN通路

《Pathology - Research and Practice》：RNF6 activates JNK/c-JUN pathway in ovarian cancer by promoting K48-linked NME4 ubiquitination

RNF6通过泛素化降解NME4激活JNK通路促进卵巢癌恶性进展，沉默RNF6可抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及上皮间质转化，并逆转NME4缺失效应。裸鼠移植瘤模型证实RNF6在OC中的促癌作用。该机制为卵巢癌靶向治疗提供新思路。

　　

李涛琼|钱飞|陈雨梅|李伟

摘要

背景

RING finger蛋白6（RNF6）属于E3泛素连接酶家族，已被证实与多种癌症有关，但其在卵巢癌（OC）中的功能意义和调控机制仍不甚明了。

方法

利用TCGA数据分析了RNF6的表达水平，并通过IHC、qRT-PCR和Western blotting在OC组织或细胞系中进行了验证。通过CCK-8、集落形成、伤口愈合、Transwell实验以及EMT标志物检测评估了RNF6的功能作用。通过Co-IP、CHX追踪和泛素化检测研究了蛋白质相互作用和泛素化模式。通过共同调节RNF6和NME4的表达进行了拯救实验。使用裸鼠异种移植模型评估了体内肿瘤发生情况。

结果

RNF6在OC中显著过表达，并与不良预后相关。沉默RNF6可以抑制细胞生长、侵袭行为和EMT过程，同时增强NME4的表达。机制分析表明，RNF6直接结合NME4并促进其K48连接的多聚泛素化，从而导致蛋白酶体降解。敲低NME4可逆转RNF6缺失的肿瘤抑制效应，并重新激活JNK/c-JUN通路。在体内实验中，沉默RNF6显著减少了肿瘤负担并影响了下游信号传导事件。

结论

RNF6通过破坏NME4的稳定性并激活JNK级联反应促进了OC的恶性进展。这一新发现的RNF6/NME4/JNK轴为OC的治疗提供了潜在靶点。

引言

卵巢癌（OC）仍然是全球最具致命性的妇科恶性肿瘤，每年约有314,000例新发病例和207,000例相关死亡[1]、[2]、[3]、[4]。由于缺乏特异性临床表现和有效的早期检测方法，通常导致诊断时已处于晚期，因此5年生存率低于50%[5]、[6]、[7]。标准治疗方法是进行最大程度的细胞减灭手术，随后进行铂类化疗，这最初可以改善预后[8]、[9]。然而，大多数患者最终会出现疾病复发，主要是由于腹膜转移和耐药性的产生。这些临床挑战凸显了迫切需要阐明OC发病和进展的分子机制，这可能有助于识别新的治疗靶点并制定更有效的治疗策略。

癌症的一个关键特征是蛋白质稳态的失调[10]。泛素-蛋白酶体系统（UPS）负责调控细胞内蛋白质的靶向降解，在维持细胞蛋白质质量控制中起着关键作用[11]、[12]。该系统的核心是E3泛素连接酶，它们赋予底物特异性，并负责识别和标记需要降解的蛋白质[13]、[14]。越来越多的证据表明，多种E3连接酶在多种癌症类型中具有致癌作用，它们通过降解肿瘤抑制蛋白来调节细胞增殖、凋亡和转移[15]、[16]。其中，RNF6作为E3泛素连接酶家族的一员，在多种癌症中被认为是一种潜在的致癌蛋白。例如，Liu等人指出RNF6通过抑制Hippo/Yap信号通路加速宫颈癌的进展[17]；Chai等人发现RNF6通过激活JAK2/STAT3信号通路促进视网膜母细胞瘤的耐药性[18]。然而，RNF6在OC进展中的作用仍大部分未知。

NME4（非转移细胞4）属于NME/NM23核苷二磷酸激酶家族，主要定位于线粒体中，在维持线粒体功能和能量代谢中起着重要作用[19]。近年来，由于NME4在肿瘤抑制中的潜在作用，人们对其给予了越来越多的关注[20]。研究表明，NME4能够抑制癌细胞增殖、诱导凋亡并抑制多种恶性肿瘤的转移[21]。NME4的异常表达通常与肿瘤侵袭性和不良预后相关[22]。然而，NME4在OC中的功能作用及其潜在机制仍不清楚。此外，c-Jun N末端激酶（JNK）信号通路是细胞应激反应的著名调节因子，参与了癌症生物学的多个方面，包括增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）[23]、[24]。在OC中观察到JNK信号通路的异常激活，这与不良临床结果相关[25]、[26]。了解上游调节因子如何调控JNK通路活性可以为OC的发病机制提供新的见解。

在这项研究中，我们试图探讨RNF6在OC进展中的潜在作用及其与NME4和JNK信号通路的机制关系。我们的目标是探索RNF6是否通过翻译后调控关键信号分子来调节OC的恶性进展，从而确定OC治疗的新分子靶点。

部分内容

组织样本

经医院伦理委员会批准，我们从江苏大学第四附属医院收集了50份病理学确认的正常卵巢组织和50份OC组织。

细胞培养和转染

永生化卵巢表面上皮细胞系（IOSE80）、OC细胞系（SKOV3、A2780、OVCAR3和ES2）以及人外周血单核细胞系THP-1均来自欧洲认证的细胞培养库。OVCAR3细胞在RPMI-1640培养基（Gibco，美国）中培养。

RNF6在OC中过表达并与不良预后相关

我们首先使用TCGA数据库评估了多种癌症类型中的RNF6表达情况。分析结果显示，RNF6在多种肿瘤组织中显著过表达，包括卵巢浆液性囊腺癌（图1A, B）。与此一致的是，IHC、qRT-PCR和Western blot检测显示OC组织中的RNF6蛋白水平明显高于正常卵巢组织（图1C–E）。此外，OC细胞系（SKOV3）中的RNF6蛋白表达也显著升高。

讨论

卵巢癌（OC）仍然是最具致命性的妇科恶性肿瘤，这主要是由于诊断时已处于晚期且治疗选择有限[28]、[29]。尽管治疗策略有所进展，OC患者的预后仍然较差，这凸显了阐明驱动疾病进展的分子机制的必要性[30]。在本研究中，我们发现RNF6是OC恶性进展的关键因素。我们的研究结果表明，RNF6在OC中显著过表达并促进肿瘤发展。

伦理批准

本研究获得了江苏大学第四附属医院的批准。

资助

镇江妇产科临床医学研究中心的开放研究项目（SS2022003-KFA02）。

CRediT作者贡献声明

钱飞：撰写初稿、数据可视化、验证。陈雨梅：项目管理、数据整理、概念构思。李伟：资金获取、正式分析。李涛琼：软件使用、资源提供、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突

致谢

不适用。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

知情同意

所有患者均已签署书面知情同意书。

作者贡献

TL和FQ设计了这项研究。YC和WL完成了所有实验、数据分析及图表制作。TL和WL起草了初稿。WL审阅并修改了最终稿件。所有作者均阅读并批准了最终稿件。