《FEBS Open Bio》：Microglial dynamics and ferroptosis induction in human iPSC-derived neuron–astrocyte–microglia tri-cultures
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本研究通过构建人诱导多能干细胞（iPSC）分化的神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞三元培养模型，系统解析了小胶质细胞在复杂微环境中的动态特征及铁死亡（ferroptosis）诱导机制。研究结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和细胞因子检测，发现三元培养可激活小胶质细胞内吞和神经元相关功能基因，并在铁过载与GPX4抑制剂RSL3作用下触发铁死亡，伴随铁蛋白重链（FTH1）上调和IL-8分泌。该模型为神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的细胞互斥研究和药物开发提供了重要平台。
研究背景
小胶质细胞作为中枢神经系统（CNS）的免疫细胞，在维持脑内稳态中发挥关键作用，其功能异常与阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病密切相关。近年来，人诱导多能干细胞（iPSC）技术为构建多细胞互斥模型提供了新思路。本研究通过建立人iPSC分化的神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞三元培养体系，旨在模拟体内微环境，揭示小胶质细胞在细胞互斥中的动态变化及对铁死亡的响应机制。
研究方法
研究采用人iPSC（克隆253G1）分化为皮质神经元祖细胞（NPC）、小胶质细胞和星形胶质细胞，构建单培养、共培养（神经元-小胶质细胞、神经元-星形胶质细胞）及三元培养体系。通过免疫细胞化学（ICC）检测细胞标记物（如IBA1、MAP2、GFAP），酶联免疫吸附试验（ELISA）分析补体C3和IL-8分泌，并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析小胶质细胞的转录组特征。为模拟铁代谢异常，研究在三元培养中加入铁剂（FeSO4）和铁死亡诱导剂RSL3（GPX4抑制剂），并利用抗氧化剂4-MMPB和liproxstatin-1（lip-1）验证铁死亡特异性。
三元培养模型的细胞互斥特征
在三元培养中，小胶质细胞与神经元、星形胶质细胞形成复杂网络。补体C3的分泌水平在小胶质细胞与神经元共培养中显著升高，而加入星形胶质细胞后进一步增加，表明星形胶质细胞通过TNF-α等因子增强小胶质细胞的C3分泌，形成反馈调节环路（图1C、1D）。
小胶质细胞转录状态的多样性
scRNA-seq分析显示，与单培养相比，三元培养中的小胶质细胞上调基因富集于神经系统发育、轴突导向和内吞功能，而下调基因涉及线粒体电子传递和病毒响应（图2B、2C）。通过聚类分析识别出10个小胶质细胞亚群，其中单培养特异性集群（c00-c02）与炎症状态相关，而三元培养主导的集群（c03、c04）高表达内吞循环和自噬相关基因。值得注意的是，仅存在于共培养和三元培养的c07集群显著富集于化学突触传递和轴突延伸调节基因，提示小胶质细胞的功能受神经元与星形胶质细胞协同调控（图3A-D）。
铁死亡诱导的小胶质细胞响应
在三元培养中，铁过载（400 μM FeSO4）联合RSL3（1 μM）处理48小时后，小胶质细胞数量显著减少，并伴随铁蛋白重链（FTH1）与IBA1共定位，证实铁死亡发生（图4B、4C）。细胞因子筛查发现IL-8和氧化低密度脂蛋白受体1（OLR1）持续上调，且IL-8升高可被铁死亡抑制剂逆转（图4D，表1）。scRNA-seq进一步显示，铁死亡扰动后，小胶质细胞集群比例发生重组：与内吞途径相关的i00、i02集群减少，而与突触功能相关的i03、i08、i09集群增加。差异表达基因富集于铁死亡负调控、内质网应激和自噬通路（图5A-E）。
研究意义与展望
本研究表明，人iPSC三元培养模型能有效模拟小胶质细胞在复杂微环境中的动态功能，并捕捉其铁死亡病理特征。该模型为解析阿尔茨海默病中铁代谢异常与小胶质细胞衰退的关联提供了新工具，未来可通过引入疾病相关基因变异，进一步揭示神经退行性变的细胞机制。
