MBD2介导GPX4转录抑制驱动多囊卵巢综合征中卵巢颗粒细胞铁死亡的表观遗传机制

《Redox Biology》：Methylation reader MBD2-mediated GPX4 transcriptional repression drives ovarian granulosa cell ferroptosis in PCOS

本研究揭示了多囊卵巢综合征（PCOS）中卵巢颗粒细胞（GC）铁死亡的新机制。研究人员发现DNA甲基化阅读器MBD2通过识别DNMT催化的GPX4启动子高甲基化，并招募MAZ、HDAC3和NCoR形成转录抑制复合物，从而抑制关键抗铁死亡酶GPX4的表达，导致GC铁死亡和PCOS病理进展。重要的是，MBD2抑制剂KCC-07能够逆转这一过程，为PCOS治疗提供了新的靶点。该研究发表于《Redox Biology》，为理解PCOS的发病机制和治疗策略提供了重要见解。

　　

多囊卵巢综合征（PCOS）是影响育龄妇女最常见的内分泌疾病之一，其特征包括卵泡发育停滞和排卵障碍，是导致女性不孕的主要原因。尽管其发病率高达15%，但PCOS的具体发病机制尚未完全阐明。近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）逐渐引起关注，其特征是铁依赖性的脂质过氧化物累积。临床观察发现PCOS患者血清铁蛋白水平升高、转铁蛋白受体（TFRC）介导的铁摄取增加、活性氧（ROS）过度积累和脂质过氧化增强，这些都与铁死亡的生物医学特征相符。然而，铁死亡在PCOS中的具体作用及其调控机制仍不清楚。

在这项发表于《Redox Biology》的研究中，研究人员深入探讨了DNA甲基化阅读器MBD2在PCOS卵巢颗粒细胞铁死亡中的调控作用。他们发现，在脱氢表雄酮（DHEA）诱导的PCOS小鼠模型中，颗粒细胞表现出明显的铁死亡特征和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的转录抑制。GPX4是一种关键的抗铁死亡酶，能够将脂质氢过氧化物（L-OOH）还原为脂质醇（L-OH），从而抑制铁死亡。

为了验证GPX4在PCOS中的关键作用，研究人员构建了颗粒细胞特异性Gpx4基因敲除小鼠（Gpx4^GC-/-）。实验结果表明，Gpx4缺失加剧了铁死亡，损害了卵泡成熟，减少了黄体形成，并加重了PCOS的病理特征。机制上，GPX4的抑制与DNA甲基转移酶（DNMTs）增加、DNA甲基阅读蛋白MBD2上调以及Gpx4启动子高甲基化相关。

通过整合ATAC-seq和RNA-seq分析，研究人员发现PCOS卵巢中Gpx4启动子的可及性增强，其中MBD2、MAZ、HDAC3和NCoR组装成一个抑制复合物，该复合物可被KCC-07处理所破坏。重要的是，用RSL3进行GPX4药理抑制或颗粒细胞特异性Gpx4缺失消除了MBD2抑制的保护作用，确立了GPX4抑制是关键的下游效应器。

研究人员还发现，用MBD2抑制剂KCC-07或DNMT阻断剂5-氮杂胞苷（5-Azacytidine）进行干预，可以恢复GPX4表达，减少脂质过氧化和颗粒细胞铁死亡，并改善卵巢功能障碍。这些发现揭示了一个MBD2驱动的表观遗传程序，该程序通过沉默GPX4、触发颗粒细胞铁死亡而促进PCOS发病。靶向MBD2以恢复铁死亡的表观遗传控制，为PCOS提供了一个有前景的治疗策略。

主要技术方法

本研究综合运用了多种实验技术：建立了DHEA诱导的PCOS小鼠模型和颗粒细胞特异性Gpx4基因敲除小鼠模型；通过免疫组织化学/免疫荧光染色、蛋白质印迹和qRT-PCR检测蛋白和mRNA表达；采用甲基化特异性PCR（MSP）和亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）分析Gpx4启动子甲基化状态；利用ATAC-seq和RNA-seq进行表观基因组和转录组分析；通过染色质免疫沉淀（ChIP）和免疫共沉淀（Co-IP）研究蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用；使用C11-BODIPY探针和丙二醛（MDA）测定评估脂质过氧化水平；通过透射电镜观察线粒体超微结构。临床样本分析基于GEO数据库中的两个RNA-seq数据集（GSE293353和GSE277906），包含24名PCOS女性和24名健康对照的卵巢颗粒细胞样本。

3.1. PCOS卵巢表现出严重的铁死亡和GPX4转录抑制

在DHEA诱导的PCOS小鼠模型中，研究人员观察到小鼠体重增加、卵巢重量减轻、黄体数量减少、窦前卵泡数量增加以及卵巢内明显的胶原沉积。组织学分析显示TUNEL阳性的颗粒细胞数量增加和铁沉积，透射电镜揭示了典型的铁死亡超微结构变化，包括线粒体变小、嵴减少和线粒体膜破裂。在分子水平上，GPX4的蛋白和mRNA表达均显著降低，而4-HNE、α-SMA和I型胶原（Col1α）水平升高。对人类PCOS患者卵巢颗粒细胞的RNA-seq数据分析同样显示GPX4表达显著下调。体外实验中，DHEA处理的颗粒细胞也表现出GPX4抑制和4-HNE水平升高，伴随脂质过氧化增加和细胞凋亡增强。

3.2. 颗粒细胞特异性GPX4敲除加剧卵巢铁死亡

与Gpx4^fl/fl同窝小鼠相比，Gpx4^GC-/-小鼠在7周时卵巢明显变小，而总体重与对照组相当。生化分析显示MDA水平显著升高，组织学检查显示卵巢形态异常和细胞凋亡增加。当接受DHEA处理后，这些病理特征进一步加剧，表现为更高的MDA水平、黄体显著减少、窦前卵泡增加、广泛胶原沉积和细胞凋亡增强。蛋白质印迹证实Gpx4^GC-/-小鼠卵巢GPX4显著降低，伴随4-HNE、α-SMA和Col1α水平升高，这些改变在DHEA处理后进一步强化。

3.3. GPX4抑制由DNMT和MBD2介导的GPX4启动子高甲基化触发

对Gpx4启动子区域的分析发现了一个密集的CpG岛簇。MSP和BSP显示该区域在DHEA处理的小鼠卵巢中显著高甲基化。RNA-seq分析进一步显示DHEA处理的小鼠卵巢中Dnmt1和Dnmt3a显著上调。免疫组化和免疫印迹检测表明，DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNA甲基阅读器MBD2在DHEA处理后显著上调，而MBD1、MBD3、MBD4和MeCP2的表达保持不变。用DNMT抑制剂5-氮杂胞苷处理可显著逆转Gpx4启动子的高甲基化。

3.4. GPX4抑制由MBD2、MAZ、HDAC3和NCoR组成的抑制复合物介导

整合的RNA-seq和ATAC-seq分析显示，DHEA处理的小鼠卵巢中Gpx4基因座的染色质可及性增加。Motif富集分析在Gpx4启动子内鉴定出几个候选转录因子结合位点，其中MAZ显示显著的motif富集和转录表达增加。足迹分析进一步证明DHEA处理的卵巢中MAZ结合motif（-196/AGGGAGGG）的转座酶可及性降低。MAZ与转录共抑制因子NCoR和HDAC3的表达在DHEA处理的卵巢中显著升高。Co-IP实验证实了MAZ、MBD2、NCoR和HDAC3在DHEA处理的卵巢组织中存在诱导性相互作用。ChIP实验进一步揭示MAZ与MBD2、NCoR和HDAC3被招募到Gpx4启动子的MAZ motif区域，这一过程可被KCC-07逆转。功能上，用HDAC3选择性抑制剂RGFP966或靶向MAZ和NCoR的siRNA处理，均能显著挽救DHEA暴露抑制的GPX4表达。

3.5. KCC-07抑制MBD2减轻颗粒细胞脂质过氧化

用MBD2抑制剂KCC-07处理DHEA刺激的颗粒细胞，可逆转DHEA诱导的脂质过氧化，其效果与铁死亡抑制剂Liproxstatin-1相当。蛋白质印迹检测证实，用KCC-07或5-氮杂胞苷处理DHEA刺激的颗粒细胞，可降低4-HNE水平，增加GPX4、FSHR和Cyp19a1的蛋白表达。

3.6. DNMT和MBD2的药理抑制减轻卵巢铁死亡和PCOS病理

体内实验表明，5-氮杂胞苷和KCC-07均能显著改善DHEA诱导的PCOS小鼠的卵巢功能，表现为增加黄体数量、减少窦前卵泡、降低胶原沉积和细胞凋亡、恢复GPX4表达和降低MDA水平。透射电镜观察显示，DHEA处理引起的铁死亡线粒体变化可被5-氮杂胞苷和KCC-07逆转。这两种处理也显著使DHEA诱导的PCOS卵巢中GPX4、4-HNE、Col1α和α-SMA的表达正常化。

3.7. RSL3抑制GPX4消除了KCC-07在PCOS小鼠中的抗铁死亡作用

用GPX4选择性抑制剂RSL3处理的小鼠表现出明显的卵巢损伤，其特征是卵巢大小减小、黄体减少、窦前卵泡增加以及胶原沉积和细胞凋亡增强，这些变化在DHEA处理后加剧。KCC-07改善了这些病理改变，但联合使用RSL3有效地消除了KCC-07对卵巢功能的保护作用。同样，KCC-07显著逆转了DHEA诱导的PCOS卵巢中GPX4、4-HNE、Col1α和α-SMA的异常表达，但这些改善在很大程度上被RSL3处理所消除。

3.8. 颗粒细胞GPX4缺失阻断了MBD2抑制在PCOS小鼠中的抗铁死亡和卵巢保护作用

Gpx4^GC-/-小鼠表现出更少的黄体、更多的窦前卵泡、增加的胶原沉积和TUNEL阳性细胞，无论是在DHEA处理前还是处理后。KCC-07给药有效改善了Gpx4^fl/fl小鼠中DHEA诱导的卵巢功能障碍并减少了TUNEL阳性细胞，但这些抗铁死亡和卵巢保护作用在Gpx4^GC-/-小鼠中大大减弱。同样，KCC-07显著使Gpx4^fl/fl卵巢中DHEA诱导的GPX4、4-HNE、Col1α和α-SMA的异常表达正常化，但这些效应在Gpx4^GC-/-小鼠中被显著消除。

研究结论与意义

本研究证实了DNMT和MBD2介导的GPX4启动子高甲基化在PCOS发病机制中的关键作用。MBD2作为特异性甲基化"阅读器"，通过招募MAZ、HDAC3和NCoR形成转录抑制复合物，导致GPX4持续沉默，进而削弱颗粒细胞的抗氧化能力，促进脂质过氧化并触发铁死亡，最终导致卵泡闭锁和卵巢功能障碍。研究不仅揭示了PCOS中氧化还原失衡的新机制，还将表观遗传调控与铁死亡这两个快速发展的研究领域联系起来，确立了DNA甲基化作为通过GPX4抑制控制铁死亡的核心表观遗传开关。此外，研究强调了靶向MBD2而非DNMT的治疗优势，可避免全基因组去甲基化的脱靶毒性，为PCOS治疗提供了更精确的干预策略。这些发现为理解PCOS的发病机制和治疗策略提供了重要见解，同时MBD2-GPX4轴可能代表了一种调控铁死亡的广泛表观遗传-转录交叉对话机制，在多种病理环境中具有普遍意义。