《Redox Biology》：Unveiling a novel function of Aconitase-2: attenuating lung ischemia-reperfusion injury via inhibition of pulmonary endothelial apoptosis
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本研究针对肺缺血再灌注损伤（LIRI）中肺血管内皮细胞（PVECs）线粒体功能障碍的核心问题，通过单细胞转录组测序发现ACO2是关键差异基因。研究人员通过体内外实验证实，ACO2过表达可通过增强TCA循环活性、改善线粒体功能、抑制细胞凋亡来减轻LIRI；而ACO2敲除则加重损伤。值得注意的是，ACO2下游代谢产物衣康酸的衍生物4-OI可逆转ACO2缺失引起的损伤。该研究发表于《Redox Biology》，为LIRI提供了新的治疗靶点。
当肺部经历缺血后恢复血液供应时，反而会出现更严重的组织损伤，这一现象被称为肺缺血再灌注损伤（LIRI）。这种情况在肺移植、体外循环和严重创伤等临床场景中尤为常见，是导致患者预后不良的重要原因。尽管医学技术不断进步，但LIRI引发的发病率和死亡率仍然居高不下，其核心问题在于缺血再灌注过程中复杂的病理生理变化，包括氧化应激、炎症反应和细胞功能障碍等。在众多受累细胞类型中，肺血管内皮细胞（PVECs）扮演着关键角色，它们如同血管的"守门人"，维持着血管屏障功能的完整性。一旦这些细胞受损，血管通透性增加，液体渗出，最终导致肺水肿和器官功能衰竭。
在这一病理过程中，线粒体作为细胞的"能量工厂"，其功能紊乱被认为是LIRI的核心环节。在缺血阶段，氧气和营养物质供应中断导致线粒体功能受损，ATP生成减少，代谢中间产物堆积。而当血液重新灌注时，会爆发大量活性氧（ROS），进一步破坏三羧酸（TCA）循环，加剧线粒体损伤。TCA循环是线粒体内核心的代谢通路，对能量生成和氧化还原平衡维持至关重要。因此，靶向线粒体代谢可能成为治疗LIRI的新策略。
近日发表在《Redox Biology》上的一项研究，将目光投向了TCA循环中的关键酶——乌头酸酶2（ACO2）。ACO2负责催化柠檬酸向异柠檬酸的转化，在调节线粒体能量输出和氧化还原平衡中发挥重要作用。尽管已有证据表明ACO2在其他缺血相关疾病中具有保护作用，但它在LIRI中的具体功能，尤其是在肺血管内皮细胞中的作用，尚不完全清楚。
为了解决这一问题，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们首先通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对小鼠肺组织细胞进行了精细分型，发现内皮细胞是LIRI中最主要的受累细胞群体。结合转录组学数据分析，研究人员筛选出23个核心基因，其中5个与TCA循环相关，而ACO2引起了他们的特别关注。
有趣的是，临床样本分析显示，LIRI患者血清中ACO2水平显著升高，且与肺功能指标呈负相关，表明血清ACO2可能成为LIRI的诊断生物标志物。然而，在肺组织和小鼠原代肺血管内皮细胞中，ACO2的表达却在缺血再灌注后明显下降，这种看似矛盾的现象可能反映了细胞损伤导致的ACO2泄漏。
为了验证ACO2的功能，研究人员在体内外进行了基因操作。在细胞实验中，ACO2过表达显著改善了线粒体功能：增强了电子传递链（ETC）复合物活性，提高了NAD+/NADH和ATP/ADP比值，减少了线粒体活性氧产生。更重要的是，ACO2过表达明显减轻了缺氧/复氧（H/R）诱导的细胞凋亡。相反，当研究人员使用CRISPR/Cas9技术敲除ACO2后，线粒体功能进一步恶化，细胞凋亡加剧。
在动物层面，研究人员通过腺相关病毒（AAV）介导的肺特异性ACO2过表达，也观察到了类似的保护效果。ACO2过表达显著改善了I/R小鼠的氧合功能，减轻了肺组织病理损伤，降低了炎症反应和氧化应激水平。而使用ACO2抑制剂Tricarballylic acid（TA）则加重了肺损伤。
机制上，研究人员发现ACO2通过调节TCA循环代谢流发挥保护作用。特别值得关注的是，ACO2的下游代谢产物衣康酸可能介导了其保护效应。实验表明，衣康酸的细胞可渗透衍生物4-辛基衣康酸（4-OI）能够逆转ACO2缺失引起的线粒体功能障碍和细胞凋亡。
此外，研究人员还发现转录因子GLYR1能够结合ACO2启动子区域并增强其转录活性，这为理解ACO2的表达调控提供了新视角。
关键技术方法
本研究整合了多种先进技术：通过单细胞和批量RNA测序分析肺组织转录谱；利用腺相关病毒实现肺特异性ACO2过表达；采用CRISPR/Cas9技术构建ACO2敲除细胞模型；通过线粒体代谢组学分析TCA循环代谢物变化；结合酶学方法和荧光探针评估线粒体功能参数。临床样本来自65名健康供体和48例LIRI患者队列。
单细胞和批量转录组分析揭示LIRI中内皮细胞的特征
研究人员首先通过scRNA-seq对21,522个小鼠肺组织细胞进行分析，最终保留12,449个高质量细胞，聚类为6个细胞亚群。结果显示，在I/R组织中内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等比例增加。内皮细胞标志物表达上调，KEGG分析显示TCA循环在I/R样本中显著上调。整合分析确定了23个核心基因，其中5个与TCA循环相关，ACO2是重点研究对象。
LIRI过程中肺组织ACO2表达降低而循环中水平升高
临床研究发现LIRI患者血清ACO2水平显著升高，且与PaO2和PaO2/FiO2比值负相关，与PaCO2正相关。然而在LIRI模型和小鼠原代PVECs中，ACO2表达在mRNA和蛋白水平均显著下调，这种差异可能反映了细胞损伤导致的ACO2泄漏。
线粒体代谢组学显示ACO2通过TCA循环调节线粒体代谢
ACO2过表达增强了ETC复合物相关基因表达和活性，减少mtDNA损伤和氧化应激。代谢组学分析显示ACO2过表达提高了关键TCA循环中间产物水平，包括衣康酸和异柠檬酸，同时增加了NAD+/NADH和ATP/ADP比值。
肺特异性ACO2过表达减轻体内肺损伤和凋亡
AAV介导的ACO2过表达改善了I/R小鼠的血气参数，减轻了肺泡壁增厚和肺水肿，降低了支气管肺泡灌洗液中的细胞总数和蛋白浓度，减少了炎症因子表达，提高了总抗氧化能力并降低了丙二醛含量。在分子水平上，ACO2过表达下调了促凋亡基因表达，上调了抗凋亡基因Bcl-2表达。
ACO2敲除加剧体外线粒体损伤和凋亡
ACO2敲除加重了线粒体超微结构损伤，降低了ATP产量和mtDNA拷贝数，增加了线粒体超氧化物水平，损害了氧消耗率，抑制了衣康酸产生。在分子水平上，ACO2敲除下调了Bcl-2表达，上调了BAX和Caspase-9表达，增加了细胞色素c释放。
4-OI挽救ACO2敲除后的线粒体功能障碍
4-OI处理恢复了线粒体质量和膜电位，改善了线粒体呼吸功能，增强了ETC复合物活性，提高了NAD+/NADH和ATP/ADP比值，发挥了抗凋亡作用。
4-OI补充减轻ACO2抑制相关的肺损伤
在体内实验中，4-OI改善了TA引起的血气参数异常，减轻了肺损伤评分和肺水肿，降低了支气管肺泡灌洗液中的细胞总数和蛋白浓度，恢复了ETC复合物蛋白水平，发挥了抗凋亡效应。
GLYR1结合ACO2启动子并增强其转录活性
生物信息学预测和实验验证表明GLYR1是ACO2的上游转录调节因子，能够直接结合ACO2启动子区域。GLYR1过表达通过ACO2依赖的方式增强了线粒体功能，减少了细胞凋亡。
研究结论与意义
本研究系统阐明了ACO2在LIRI中的保护作用及机制。研究发现ACO2通过维持TCA循环通量，改善线粒体功能，减少氧化应激和细胞凋亡，从而减轻肺损伤。ACO2下游代谢产物衣康酸是其发挥作用的关键介质，而转录因子GLYR1是新发现的ACO2上游调控因子。这些发现不仅深化了对LIRI发病机制的理解，也为临床治疗提供了新的潜在靶点。ACO2激动剂或衣康酸衍生物可能成为治疗LIRI的新策略，具有重要的转化医学价值。
