基于多层代谢工程策略的大肠杆菌L-2-氨基丁酸从头合成研究

《Synthetic and Systems Biotechnology》：De novo synthesis of L-2-aminobutyric acid in Escherichia coli based on multi-layered metabolic engineering strategies

本研究针对L-2-氨基丁酸(L-2-ABA)发酵生产中存在的中间体毒性和代谢通量不平衡问题，通过构建群体感应动态调控回路解耦细胞生长与2-氧代丁酸(2-OBA)合成，结合LeuDHK72A优化、模型指导的碳通量重分配、辅因子工程和全局转录调控，最终获得无需抗生素或诱导剂的高产菌株ABA40，在5L发酵罐中实现45.3 g/L的L-2-ABA产量，为非天然氨基酸的生物合成提供了动态整合策略范例。

　　

在医药和精细化工领域，L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyric acid, L-2-ABA)作为一种非蛋白质源性氨基酸，是多种手性药物的重要合成砌块。然而，其工业化生产长期面临两大技术瓶颈：中间体2-氧代丁酸(2-oxobutyric acid, 2-OBA)的细胞毒性会抑制菌体生长，而转氨反应的可逆性则导致产物得率受限。虽然化学合成法存在反应条件苛刻、收率低等问题，但现有生物法同样受制于氨基酸供体消耗和副产物生成。更棘手的是，2-OBA的积累与细胞生长之间存在固有矛盾——过早合成会抑制生长，而过晚启动又会导致前体供应不足。这一"生长-生产"的权衡难题，成为提升L-2-ABA发酵水平的根本性障碍。

面对这一挑战，青岛农业大学生命科学学院赵振强团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表论文，报道了一种基于多层代谢工程策略的大肠杆菌L-2-ABA从头合成方法。研究人员以高产L-苏氨酸的THR47菌株为底盘，通过引入Esa群体感应(quorum-sensing, QS)回路动态调控苏氨酸脱水酶(IlvA^F352A,R362F)的表达，巧妙实现了生长阶段与生产阶段的时序分离。当菌体密度达到阈值时，自体诱导剂AHL累积并解除对P_trc-esaO启动子的抑制，从而启动2-OBA合成。这种"细胞密度感应开关"使工程菌ABA04-L25的2-OBA产量提升48.6%，生物量提高64.8%。

在转化模块优化中，团队比较了酪氨酸转氨酶(TyrB)与亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase, LeuDH)两条路线，发现来自西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)的LeuDH^K72A突变体能以氨为氨基供体直接催化还原胺化反应，避免了氨基酸消耗和副产物生成。通过多拷贝染色体整合，使ABA12菌株的L-2-ABA产量达到5.93 g/L，同时将2-OBA积累量降至1.90 g/L。

研究还采用基因组尺度代谢网络模型(genome-scale metabolic network model, GSMN)指导代谢改造。基于iML1515模型的通量平衡分析(flux balance analysis, FBA)预测，限制磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase, PGI)通量并增强磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)可促进产物合成。实验验证表明，启动子工程优化的zwf表达菌株ABA18产量达6.94 g/L。OptKnock算法进一步预测丙酮酸激酶(pykF)敲除可增强磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)供应，使ABA20产量提升至7.91 g/L。

针对LeuDH催化所需的NADH供给问题，研究人员尝试了多种辅因子工程策略：异源表达甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH)并优化甲酸铵补料策略，使产量最高提升12.3%；但吡啶核苷酸转氢酶(SthA)过表达会干扰L-苏氨酸合成所需的NADPH平衡，反而导致产量下降。此外，通过精确调控外排蛋白RhtA/RhtC和动态控制乙酰羟酸合酶(acetohydroxy acid synthase, AHAS)表达，实现了前体供给与消耗的再平衡。最后通过转录调控因子工程（过表达PdhR、引入SpoT^R290E,K292D突变）增强碳通量分配效率，最终构建的ABA40菌株在5L发酵罐中经72小时培养，L-2-ABA产量达45.3 g/L，得率为0.31 g/g葡萄糖。

关键技术方法包括：CRISPR/Cas9辅助的基因组整合技术用于基因表达调控；群体感应动态控制系统实现生长-生产解耦；基因组尺度代谢模型(iML1515)指导的代谢通量优化；实时荧光定量PCR用于基因表达分析；5L生物反应器补料分批发酵工艺优化。

3.1. 动态调控ilvA基因实现两阶段2-氧代丁酸生产

通过将Esa群体感应系统与杂交启动子P_trc-esaO耦合，实现了苏氨酸脱水酶表达的时空调控。当AHL浓度随菌体密度增加后，解除对启动子的抑制，使ABA04-L25菌株在维持高生物量(OD₆₀₀=15.36)的同时，2-OBA产量达到6.42 g/L。

3.2. 优化LeuDH表达实现L-2-ABA高效合成

比较发现LeuDH^K72A催化效率显著优于转氨酶路线。染色体多拷贝整合实验表明，4拷贝LeuDH^K72A可使L-2-ABA产量达5.93 g/L，且2-OBA积累量减少约60%，证实该酶已非限速步骤。

3.3. 计算机预测增强L-2-ABA生物合成的代谢策略

通量平衡分析预测增强磷酸戊糖途径通量有利于产物合成。实验验证zwf表达优化菌株ABA18产量提升17%，而OptKnock算法预测的pykF敲除使ABA20产量进一步提高13.5%，说明PEP节点调控对碳通量重分配的关键作用。

3.4. 工程化NADH供给提升L-2-ABA产量

辅因子再生实验表明，4 g/L甲酸铵补料可有效增强NADH供应，但内源甲酸合成途径改造效果不佳。说明外源补料比内源途径重构更适用于辅因子平衡调控。

3.5. 平衡调控L-苏氨酸供给与2-OBA分解代谢

单敲除rhtA外排蛋白使L-2-ABA产量提升至9.68 g/L，但双敲除会导致前体过度积累。同时采用生长相关启动子P_fliC动态控制ilvIH表达，有效减少2-OBA消耗。

3.6. 工程化转录调控因子提升菌株抗性

全局转录调控工程发现，过表达PdhR和引入SpoT^R290E,K292D可分别通过调控丙酮酸代谢和扩大前体库提升产量2.8%和2.1%，而应激响应因子RpoS过表达会产生负面影响。

该研究通过多层代谢工程策略，成功构建了无需诱导剂和抗生素的L-2-ABA高产菌株。群体感应动态控制系统有效协调了"生长-生产"矛盾，模型指导的代谢改造实现了碳通量的精准定向，辅因子工程和转录调控优化增强了细胞工厂的整体性能。这种动态调控与静态优化相结合的方法，为高毒性中间体产品的微生物制造提供了新范式，尤其适用于需要精确时序控制的复杂代谢途径工程。研究展示的45.3 g/L发酵水平，是目前报道的L-2-ABA微生物合成最高产量之一，其技术路线对非天然氨基酸及其衍生物的绿色生物制造具有重要借鉴意义。