《Synthetic and Systems Biotechnology》：Enhanced AAV production via rational design of a novel pHelper vector integrated with HSV-1 helper genes
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本研究针对AAV载体生产过程中产量低、成本高的瓶颈问题，通过理性设计将HSV-1来源的UL12和ICP22基因整合至经E2a/E4区域删减的mini-pHelper骨架，成功构建UL12-ICP22-miniHelper新型辅助质粒。实验表明该质粒可使AAV5产量提升2.11倍（2.85×1011vg/mL），并在AAV1/2/6/9等多种血清型中实现1.54-2.24倍增产，同时维持完整衣壳比例和转导效率。该研究为基因治疗领域提供了一种普适性、低成本的高效AAV生产策略。
在基因治疗领域，腺相关病毒（AAV）载体因其安全性高、免疫原性低、可长期表达外源基因等优势，已成为递送治疗基因的明星平台。目前已有包括治疗视网膜营养不良的Luxturna?、治疗脊髓性肌萎缩的Zolgensma?等AAV基因疗法药物获批上市。然而，AAV载体的大规模生产仍面临严峻挑战——采用传统三质粒（包含AAV基因组质粒、Rep/Cap质粒和腺病毒辅助质粒pHelper）在HEK293细胞中转染的生产方式，其产量往往比野生型腺病毒共感染低10倍左右，导致生产成本高昂，严重限制了其临床转化和商业化应用。因此，如何通过优化生产系统，特别是改造辅助质粒来提高AAV产量，是当前基因治疗产业发展亟待解决的关键问题。
以往研究表明，除腺病毒外，单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、人博卡病毒1型（HBoV1）等病毒也能为AAV复制提供辅助功能。这些病毒的某些辅助因子被证实可促进AAV基因组复制或增强Rep/Cap蛋白表达。同时，有研究尝试通过删除pHelper质粒中非必需区域（如E2a基因内含子、E4基因的ORF1-4）来减小质粒大小，以期提高转染效率。那么，能否将不同来源的高效辅助因子整合到一个经过尺寸优化的微型pHelper骨架中，从而协同提升AAV产量呢？发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上的这项研究正是针对这一科学问题展开了深入探索。
为了开展研究，作者团队运用了分子克隆技术构建了一系列重组质粒，包括将筛选出的病毒辅助因子克隆至pcDNA3.1载体，以及将优选因子整合至pHelper或经过删减的mini-pHelper骨架中。研究采用四质粒和三质粒转染系统在悬浮培养的HEK293细胞中生产AAV载体。通过实时荧光定量PCR（qPCR）定量分析载体基因组滴度、复制的病毒DNA以及辅助质粒的细胞摄取量；通过RT-qPCR和蛋白质印迹（Western Blot）分别检测Rep和Cap基因的转录水平和蛋白表达水平；采用阴离子交换层析结合高效液相色谱（HPLC）分析完整衣壳和空衣壳的比例；并通过流式细胞术和荧光显微镜观察评估AAV载体在HEK293细胞中的转导效率。
3.1. 通过四质粒转染评估病毒辅助因子对AAV载体产量的提升效果
研究人员首先筛选了来自HSV-1、HPV-16和HBoV1的12种候选辅助因子。通过四质粒转染系统（在标准三质粒基础上额外加入表达单个辅助因子的pcDNA3.1质粒）进行初步评估。结果显示，HSV-1来源的UL5、UL8、UL12和ICP22这四种因子能显著提高AAV5产量，增幅达1.57至2.26倍。进一步机制研究表明，这些因子能有效促进病毒基因组复制，并上调Rep和Cap基因的转录与蛋白表达水平，这为后续的辅助质粒理性设计提供了关键靶点。
3.2. 将病毒辅助因子整合至pHelper用于AAV生产
为了简化生产工艺，研究人员尝试将筛选出的有效辅助因子（单个或组合）插入到传统pHelper质粒的VA RNA和E4区域之间，构建了10种改造后的辅助质粒。结果表明，仅有整合了UL12的UL12-pHelper以及同时整合了UL12和ICP22的UL12-ICP22-pHelper能显著提高AAV5产量，分别提高1.60倍和1.72倍，并伴随病毒DNA复制和Rep/Cap表达的增强。然而，质粒尺寸的增大（最大至19.8 kb）导致细胞对质粒的摄取量下降，这提示质粒尺寸是影响生产效率的一个重要因素。
3.3. 包含E4和E2a基因内部缺失的mini-pHelper维持了AAV生产力
借鉴已有策略，研究人员构建了一个尺寸减小版的辅助质粒mini-pHelper。通过删除E2a基因中0.9 kb的内含子序列以及E4基因中ORF 1-4区域（2.5 kb），将质粒大小从12.0 kb减小到8.6 kb。实验证实，尽管E4orf6的转录水平有所下降，但mini-pHelper维持了与原始pHelper相当的AAV5生产力，甚至略有提升（1.32倍），且对Rep和Cap蛋白表达无显著负面影响，这为后续整合外源辅助因子提供了一个更优的、尺寸可控的载体骨架。
3.4. 将UL12和ICP22基因整合至mini-pHelper进一步增强了AAV载体生产
接下来，研究人员将UL12基因或UL12与ICP22基因组合整合到mini-pHelper骨架上，构建了UL12-miniHelper（11.8 kb）和UL12-ICP22-miniHelper（13.6 kb）。这两种新型质粒的尺寸与原始pHelper（12.0 kb）相近，确保了良好的细胞摄取效率。在AAV5生产中，UL12-ICP22-miniHelper表现最优，使载体产量达到2.85×1011vg/mL，相比原始pHelper（1.35×1011vg/mL）提升了2.11倍。机制分析表明，其增产效果与显著提升的病毒基因组复制水平以及Rep/Cap蛋白表达水平密切相关。此外，UL12-ICP22-miniHelper还改善了仅使用mini-pHelper时出现的完整衣壳比例下降的问题，使其恢复到约11%的正常水平。
3.5. UL12-ICP22-miniHelper提高了多种衣壳血清型的产量
为了验证新型辅助质粒的普适性，研究人员在AAV1、AAV2、AAV6和AAV9血清型中进行了测试。结果显示，UL12-ICP22-miniHelper对所有测试血清型均有增产效果，增产幅度在1.54倍（AAV2）至2.24倍（AAV1）之间，且大部分血清型也观察到了Rep和/或Cap蛋白表达的上调，表明其增产机制具有一定的广泛适用性。
3.6. UL12-ICP22-miniHelper在体外保持了相当的AAV转导效率
研究人员进一步评估了由新型辅助质粒生产的AAV载体的质量。通过用不同剂量的AAV-GFP载体（血清型1, 2, 5, 6, 9）转导HEK293细胞，并检测GFP阳性细胞比例，发现与原始pHelper生产的载体相比，UL12-ICP22-miniHelper生产的载体其转导效率相当，甚至在部分血清型的高剂量下略有提升，这表明质粒的改造并未损害所产AAV载体的功能。
综上所述，本研究通过理性设计，成功构建了一种新型辅助质粒UL12-ICP22-miniHelper。该质粒巧妙地结合了尺寸优化（删除pHelper非必需区域）和功能增强（整合HSV-1来源的高效辅助因子UL12和ICP22）两种策略。研究结果表明，该质粒能显著提高多种AAV血清型的生产产量，且不影响载体质量和功能。增产的机制主要与UL12促进病毒基因组复制以及ICP22增强Rep/Cap蛋白表达有关。该研究为解决AAV大规模生产中的产量瓶颈问题提供了一个高效、通用且潜在低成本的解决方案，对推动基因治疗药物的研发与商业化生产具有重要的理论和实践意义。未来研究可进一步探索该策略在不同生产系统（如昆虫细胞系统）中的应用，并深入解析UL12和ICP22与其他病毒辅助因子协同作用的分子机制。
