《Nature Immunology》：Spatial patterning of fibroblast TGFβ signaling underlies treatment resistance in rheumatoid arthritis
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本研究针对难治性类风湿关节炎（RA）的治疗困境，通过空间转录组技术发现血管周围Notch信号通过精细调控TGFβ通路，形成成纤维细胞对TGFβ敏感性的近远轴梯度分布，导致纤维化微环境扩张。抑制Notch/TGFβ信号可逆转此过程，为靶向TGFβ信号防治难治性RA提供了新策略。
在类风湿关节炎（RA）的治疗领域，尽管生物制剂的应用取得了显著进展，但仍有超过50%的患者对初始治疗无反应，5-30%的患者甚至对多种治疗方案都抵抗，这成为临床上面临的重大挑战。难治性RA患者往往表现出更多的非炎症性疼痛，提示其背后可能存在不同于典型炎症的病理生理机制。以往的研究多聚焦于免疫细胞，而对滑膜组织中另一种主要细胞——成纤维细胞在治疗抵抗中的作用了解甚少。成纤维细胞具有高度的异质性，其不同的功能状态与疾病预后密切相关。尤其值得注意的是，纤维化过程，即以成纤维细胞过度活化、细胞外基质（ECM）过度沉积为特征的病理过程，在RA中的作用尚未得到充分研究。转化生长因子β（TGFβ）是纤维化的核心介质，但其在RA滑膜组织中的具体作用模式尚不明确。
为了深入探究难治性RA的分子决定因素，研究人员在《Nature Immunology》上发表了最新研究成果。他们利用空间转录组技术，对早期RA患者治疗前及治疗6个月后的滑膜组织活检样本进行了分析。研究发现，在治疗无效患者的基线活检样本中，血管组织微环境内的纤维化信号显著增强，其特征是成纤维细胞高表达软骨寡聚基质蛋白（COMP）。机制上，内皮细胞来源的Notch信号作为上游调控因子，通过诱导TGFβ亚型表达同时抑制TGFβ受体表达，精细调控成纤维细胞的TGFβ信号，从而形成了成纤维细胞对TGFβ敏感性的由近及远的梯度分布。这种稳态模式可被Notch信号扰动所改变。治疗后活检样本显示，尽管免疫细胞显著减少，但纤维化微环境却发生扩张，这一过程可在RA患者来源的类器官中通过抑制Notch和TGFβ信号得以逆转。该研究揭示了靶向TGFβ信号以抑制滑膜组织过度纤维化，作为难治性RA潜在治疗新策略的重要性。
本研究的关键技术方法包括：对来自396.10研究的初治早期RA患者的滑膜活检样本进行高分辨率空间转录组分析；利用RA患者来源的滑膜类器官模型进行体外干预验证；构建二维和三维的成纤维细胞与内皮细胞共培养体系，模拟体内微环境并分析细胞间相互作用；结合RNAscope原位杂交、免疫荧光、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定等技术进行多组学验证。样本队列来源包括弗林德斯医学中心等多家机构的RA患者。
识别RA滑膜中的不同组织微环境
研究人员首先在17例初治早期RA患者的滑膜活检样本中，通过空间转录组分析识别出7种主要的组织微环境：富集成纤维细胞区、血管区、基质-脂肪区、衬里层成纤维细胞区、衬里层巨噬细胞区、T细胞与B细胞区以及浆细胞区。根据微环境组成，样本可大致分为三类：富含基质-脂肪的、富含免疫微环境的、以及血管和成纤维细胞微环境扩增的。尽管基线微环境组成在缓解与非缓解患者间无显著差异，但转录水平的差异可能区分预后。
非缓解患者中纤维化特征升高
通过分析更大的批量RNA测序数据，研究人员发现与非应答相关的基因特征在基质-脂肪、富集成纤维细胞和血管微环境中显著富集，其中成纤维细胞的非应答评分最高。对成纤维细胞进行亚型分析，鉴定出五种亚型，其中以高表达COL6A1、COL8A1、COMP等ECM基因为特征的纤维化成纤维细胞亚型与非应答特征关联最强，并且在非缓解患者的治疗前成纤维细胞中，纤维化评分显著升高。该纤维化特征在系统性硬化症和特发性肺纤维化等纤维化疾病的数据集中也高度富集，表明RA中的纤维化成纤维细胞与经典纤维化疾病中的肌成纤维细胞存在转录组重叠。
TGFβ信号的空间模式
为了精确定位纤维化成纤维细胞，研究人员使用靶向50个基质相关基因的面板进行深度空间转录组分析。结果显示，COMP高表达的成纤维细胞主要定位于少细胞区域和血管周围区域的远端层，而骨膜蛋白（POSTN）高表达的成纤维细胞则与血管周细胞标记物共定位，位于血管区域的近端层。对TGFβ亚型表达的分析发现，TGFB3转录本不仅与内皮细胞和周细胞标记物共定位，显示其在血管和血管周围的富集，还与包括POSTN、COMP和COL1A1在内的纤维化转录本重叠。免疫荧光染色证实了TGFβ蛋白的血管周围定位，并且TGFβ信号活化的关键指标pSMAD3也仅限于血管区域的成纤维细胞。这些发现表明血管周围微环境是纤维化信号的重要枢纽。
内皮细胞空间模式化TGFβ反应性
通过建立二维和三维共培养模型，研究人员发现内皮细胞可空间模式化成纤维细胞的转录程序。靠近内皮细胞的成纤维细胞高表达Notch靶基因和POSTN，而远离内皮细胞的成纤维细胞则高表达COMP。同时，内皮细胞近端的成纤维细胞高表达TGFB1和TGFB3，但低表达TGFβ受体（TGFBR2和TGFBR3）；相反，远离内皮细胞的成纤维细胞则表现出TGFβ受体表达逐渐增加的趋势。这表明内皮细胞来源的信号通过配对调控TGFβ配体和受体，决定了TGF信号反应性的空间模式。
Notch信号介导的TGFβ反应性模式
进一步机制探究发现，内皮细胞来源的Notch信号是成纤维细胞TGFβ信号的上游调控因子。抑制Notch信号可逆转内皮细胞共培养诱导的TGFB1、TGFB3表达上调和TGFBR2、TGFBR3表达抑制。在体外用DLL4刺激成纤维细胞也可观察到类似效应，并可被Notch抑制剂DAPT所逆转。Notch信号主要通过调控TGFβ受体III（TGFBR3）的可用性来模式化成纤维细胞对TGFβ的反应性。
Notch扰动诱导纤维化活化
破坏稳态的Notch信号会激活纤维化基因表达程序。敲低内皮细胞特异性Notch配体DLL4后，共培养体系中COMP表达被解除抑制，同时TGFBR3表达升高，TGFB3表达降低，表明COMP表达成纤维细胞的扩张与DLL4敲低介导的TGFBRIII去抑制有关。
治疗后纤维化微环境的扩张
对17对治疗前后配对滑膜样本的分析显示，治疗后所有患者组均出现显著的免疫耗竭，但纤维化微环境相对扩张。在大多数患者中，表达COMP的成纤维细胞比例增加，COMP高表达区域变得更加少细胞化，表明治疗后表达COMP的成纤维细胞发生扩张并可能沉积纤维性ECM。
靶向Notch和TGFβ信号抑制纤维化
最后，研究人员在RA患者来源的滑膜类器官中验证了靶向Notch和TGFβ信号的 therapeutic potential。用DAPT或TGFβ抑制剂处理类器官，均可显著降低COMP、POSTN和前胶原蛋白Iα1的分泌。空间转录分析进一步证实，DAPT处理可显著抑制成纤维细胞中TGFB1和TGFB3的表达，同时解除对TGFBR2和TGFBR3的抑制。
研究结论与意义
本研究首次系统地揭示了在类风湿关节炎滑膜组织中，内皮细胞来源的Notch信号通过精细调控成纤维细胞TGFβ配体与受体的表达，建立了成纤维细胞对TGFβ敏感性的空间梯度模式。这种模式在治疗压力下发生改变，导致纤维化成纤维细胞微环境扩张，与临床治疗抵抗密切相关。该发现不仅深化了对难治性RA病理机制的理解，将研究视角从免疫炎症扩展至基质纤维化，而且为开发针对TGFβ信号（特别是TGFβ3亚型）的辅助疗法，以预防难治性RA的发生提供了新的理论依据和潜在的干预靶点。
