《Nature Communications》：Inactive ryanodine receptors sustain lysosomal availability for autophagy by promoting ER-lysosomal contact site formation
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本研究揭示了内质网定位的兰尼碱受体(RyR)与溶酶体V-ATP酶的ATP6v0a1亚基相互作用，形成ER-溶酶体接触位点，动态调控溶酶体在自噬与胞吐之间的命运抉择。发现抑制RyR活性可增强ER-溶酶体接触，促进自噬流，为阿尔茨海默病等神经退行性疾病的治疗提供了新靶点。
在我们细胞的微观世界里，有两个重要的细胞器——内质网(ER)和溶酶体，它们像城市的供电系统和垃圾处理厂，分别负责钙离子储存和降解回收细胞废物。这两个细胞器之间的"对话"异常重要，尤其是通过它们之间的膜接触位点进行的钙信号交流。然而，这种对话的具体机制，特别是兰尼碱受体(RyR)这种重要的钙释放通道在其中扮演的角色，一直是个未解之谜。
在阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病中，溶酶体功能异常和自噬流受损是早期事件。先前研究发现，家族性阿尔茨海默病(FAD)中过度活跃的RyR会损害溶酶体功能，但RyR如何精确控制溶酶体功能，以及它如何与溶酶体 vacuolar H+-ATPase (vATPase)相互作用，仍然未知。这项发表在《Nature Communications》上的研究揭开了这一谜团。
研究人员采用多种先进技术手段展开研究，包括人诱导多能干细胞(hiPSC)分化的皮质神经元模型、蛋白免疫共沉淀、分子对接模拟、超高分辨率显微镜(3D-SIM)、单细胞钙成像、膜接触位点特异性探针(split greenFAST)等，系统揭示了RyR与溶酶体vATPase之间的新型相互作用。
RyR与ATP6v0a1发生物理和动态相互作用
研究发现RyR2与vATPase的ATP6v0a1亚基直接相互作用。通过免疫共沉淀实验证实，在野生型小鼠皮层样本中，内源性RyR与ATP6v0a1形成蛋白复合物，而在3xTg FAD小鼠模型中这种相互作用显著减弱。分子对接分析预测RyR2通过其胞质区与vATPase的多个亚基相互作用，包括ATP6v0a1的N端胞质结构域。
RyR与ATP6v0a1的功能性相互作用
过表达ATP6v0a1可抑制RyR2介导的钙释放，而不影响ER钙库容量。这表明ATP6v0a1对RyR2介导的钙释放的抑制是通过ATP6v0a1对RyR2的直接作用介导的。RyR2过表达显著降低了溶酶体染料负载，而ATP6v0a1过表达可挽救这种效应。
RyR2400aa片段破坏RyR2/ATP6v0a1复合物形成
研究人员设计了RyR2的400个氨基酸片段(RyR2400aa)作为诱饵，发现该片段可破坏RyR2与ATP6v0a1之间的相互作用，并部分解除ATP6v0a1对RyR2活性的抑制。竞争实验表明，RyR2400aa可逆转ATP6v0a1对溶酶体染料负载的影响。
抑制RyR促进自噬流同时抑制溶酶体胞吐
在hiPSC来源的皮质神经元中，抑制内源性RyR活性可增强自噬流，表现为自噬体与溶酶体融合增加。这种效应不涉及自噬早期阶段，而是特异性地影响自噬的晚期步骤。同时，RyR抑制减少了溶酶体胞吐，表现为细胞膜LAMP1和细胞外N-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶活性的降低。
RyR抑制不改变溶酶体酶活性但影响溶酶体定位
RyR抑制不影响溶酶体pH或酶活性，但改变了溶酶体的细胞内定位。超分辨率显微镜显示，RyR抑制使溶酶体更远离质膜，更深入ER网络内部，与RyR通道更接近。
抑制RyR活性通过增加RyR与vATPase的相互作用刺激ER-溶酶体接触位点形成
电镜和活细胞成像显示，RyR抑制增加了ER-溶酶体接触。split greenFAST探针证实，RyR抑制显著增加ER-溶酶体接触位点的数量和体积。同时，RyR与ATP6v0a1的共定位在RyR抑制后增强。
RyR2/ATP6v0a1相互作用抑制溶酶体分泌
过表达ATP6v0a1可使溶酶体定位远离ER边缘，模拟RyR抑制的效果。而表达RyR2400aa片段可增强RyR介导的钙释放和溶酶体胞吐，表明内源性RyR2-ATP6v0a1复合物控制溶酶体可用性。
研究结论表明，自发活跃的RyR通道促进溶酶体胞吐，而非活性RyR通道可与vATPase相互作用，增加ER-溶酶体接触位点形成，将溶酶体定位用于自噬。这种相互作用稳定了RyR通道的抑制状态，有利于溶酶体用于自噬而非胞吐。
这项研究的重要意义在于首次揭示了RyR作为ER-溶酶体栓系蛋白的新功能，通过动态的、钙信号依赖的方式控制溶酶体的细胞内可用性。在病理条件下，如家族性阿尔茨海默病中观察到的RyR-ATP6v0a1复合物形成减少，可能导致过度的RyR介导钙释放和溶酶体功能紊乱，这为理解神经退行性疾病的早期发病机制和治疗干预提供了新视角。研究提出的模型为靶向调节ER-溶酶体接触治疗相关疾病奠定了理论基础。
