人源COP1-DET1泛素连接酶复合物的冷冻电镜结构揭示其底物激活的构象重排机制

《Nature Communications》：Cryo-EM structure of the human COP1-DET1 ubiquitin ligase complex

本研究针对COP1-DET1-CRL4泛素连接酶复合物的组装与激活机制不明的问题，通过冷冻电镜解析了人源COP1-DET1-DDB1-DDA1-Ube2e2复合物的高分辨率结构，发现其存在非活性的层叠组装状态。底物c-Jun或ETS2的结合可诱导复合物构象重排为二聚体活性状态，并阐明DET1桥接COP1与Ube2e2启动泛素化、DDB1招募CUL4A/B-RBX1-Ube2d3促进泛素链延伸的协同机制，为E3连接酶动态调控及肿瘤靶向治疗提供新见解。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，蛋白质的降解如同一个高效的垃圾处理系统，确保异常或短寿蛋白质被及时清除。这一过程主要由泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）执行，其中E3泛素连接酶作为关键“识别官”，决定哪些蛋白质将被标记泛素链并送往蛋白酶体降解。COP1（Constitutive Photomorphogenesis 1）作为一种从植物到人类高度保守的E3连接酶，通过调控p53、c-Jun等转录因子稳定性，在细胞发育、应激反应乃至肿瘤发生中扮演核心角色。然而，COP1如何与DET1（De-etiolated 1）等蛋白组装成CRL4^DET1-COP1复合物，以及底物结合如何激活该复合物的机制，一直是领域内亟待破解的谜题。

为解决这一问题，南方科技大学苏明远团队联合香港中文大学（深圳）研究人员，在《Nature Communications》发表了题为“Cryo-EM structure of the human COP1-DET1 ubiquitin ligase complex”的研究。他们通过系统性结构生物学与生物化学分析，揭示了CRL4^DET1-COP1复合物的动态组装规律及其底物激活机制。

研究主要依托以下关键技术：利用Expi293F细胞共表达系统纯化人源COP1-DET1-DDB1-DDA1-Ube2e2复合物；通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析复合物的高分辨率结构（最高达2.65 ?）；结合凝胶过滤色谱、负染电镜和交联质谱（XL-MS）分析复合物构象变化；采用免疫共沉淀（Co-IP）和体外泛素化实验验证蛋白互作及功能；通过点突变实验鉴定关键相互作用界面。

研究结果

COP1-DET1复合物的冷冻电镜结构

研究人员首先解析了DDB1-DDA1-DET1（DDD）核心复合物的结构，发现DET1通过其N端螺旋与DDB1的BPA结构域结合，而DDA1稳定DET1构象。进一步分析COP1-DDD-Ube2e2复合物时，意外发现其存在两种组装状态：一种是八聚COP1通过卷曲螺旋域（coiled-coil domain）堆叠形成的层状纤维结构（分辨率约6.33 ?），其中仅顶层的COP1 WD40结构域可接触底物；另一种为对称二聚体（分辨率3.03 ?），其WD40结构域呈面对面排列，底物结合口袋更易接近。

DET1桥接COP1与Ube2e2的特异性识别

实验表明DET1通过其“爪状”结构域（claw domain）特异性结合Ube2e家族成员（如Ube2e2），而非Ube2d3。DET1的D324、R317等残基与Ube2e2的R88、R124形成盐桥，而COP1的WD40结构域则通过 blade IV和blade V-VI分别与DET1结合，形成“钻石形”二聚体界面。突变这些关键残基（如DET1 R488A/H485G）会显著削弱COP1-DET1-Ube2e2三元复合物的形成。

底物诱导复合物构象激活

当共表达COP1底物c-Jun或ETS2时，复合物从层叠状态转变为二聚体状态。交联质谱鉴定出COP1 WD40结构域与c-Jun的VP基序（残基223-241）存在多个交叉链接位点，证实底物结合。体外泛素化实验显示，单独Ube2e2仅能催化c-Jun单泛素化，而加入Ube2d3和nedd化CUL4A-RBX1后，可显著增强c-Jun的多聚泛素化修饰，表明DET1招募的Ube2e2启动泛素化，RBX1招募的Ube2d3负责链延伸。

结论与意义

本研究首次揭示了CRL4^DET1-COP1复合物在底物结合前后的动态构象变化：非活性层叠状态可能作为细胞内的“休眠库”，底物诱导其转变为二聚体活性状态，从而精确调控泛素化进程。DET1作为分子支架，不仅桥接COP1与Ube2e2，还通过协同不同E2酶（Ube2e2启动修饰，Ube2d3延伸链条）实现高效底物降解。这一机制深化了对E3连接酶高级组装及激活原理的理解，为针对COP1相关肿瘤通路（如c-Jun驱动的增殖异常）的药物设计提供了结构基础。未来研究需进一步探索磷酸化等修饰如何调控复合物状态转换，以及其在生理环境中的动态调控网络。