《Biochemistry and Biophysics Reports》：Single-cell transcriptome sequencing revealing the microenvironment of breast fibroepithelial tumor
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本研究针对青少年乳腺巨大纤维上皮性肿瘤发病机制不清、手术干预可能影响乳腺发育的临床难题，利用BD Rhapsody?平台对3例青少年和1例成人患者的26,737个细胞进行单细胞RNA测序。研究发现青少年肿瘤上皮细胞富集PI3K-Akt、GnRH等增殖相关通路(p<0.001)，而成人以雌激素受体通路为主；首次鉴定出占基质细胞18.7%的青少年特异性抗原呈递成纤维细胞(apCAFs)，并通过免疫组化验证HLA-DRA、CD74高表达；细胞通讯分析揭示PTN-SDC4、MDK-NCL等配体-受体介导的基质-上皮细胞交互网络。该研究为开发靶向治疗提供了新视角。
在乳腺疾病谱系中，纤维上皮性肿瘤(fibroepithelial tumors, FTs)是一类兼具上皮和间质成分增殖的双相性病变，其中青少年巨大纤维腺瘤以其快速生长特性备受关注。这些常在青春期前或早期出现的肿瘤，不仅因体积庞大压迫正常组织引发不适，更可能对正处于发育关键期的乳腺造成不可逆损伤。尽管传统认为雌激素刺激是主要诱因，但临床上针对雌激素受体调节剂如他莫昔芬的治疗效果却不尽人意，使得手术切除成为主要手段——这种"一刀切"的方案必然带来瘢痕和组织缺损的风险。更令人困惑的是，为何青少年患者的肿瘤表现出与成人迥异的生长特性？其背后的细胞异质性和微环境调控网络始终是个黑箱。
为解开这些谜团，研究团队在《Biochemistry and Biophysics Reports》发表的研究中，采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术对3例12-16岁青少年和1例42岁成人患者的肿瘤样本进行高分辨率解析。通过BD Rhapsody?平台获取26,737个高质量细胞的转录组数据，结合Harmony算法整合批次效应，利用Seurat包进行聚类分析，并采用Monocle 2构建伪时间轨迹，CellChat分析细胞通讯网络。
关键技术方法包括：单细胞RNA测序（BD Rhapsody?平台）分析4例患者样本（3例青少年+1例成人），采用Seurat包进行质量控制与聚类，Harmony算法校正批次效应，Monocle 2进行伪时间轨迹分析，CellChat解析细胞间通讯，scMetabolism评估代谢特征，并通过免疫组化验证关键发现。
3.1. 单细胞数据降维聚类结果
通过主成分分析(PCA)和均匀流形近似与投影(UMAP)将细胞分为13个亚群，最终注释为6种主要细胞类型：中性粒细胞(FCGR3B+)、T/NK细胞(CD3E+)、巨噬细胞(CD68+)、上皮细胞(EPCAM+)、成纤维细胞(COL3A1+)和内皮细胞(VWF+)。上皮细胞和成纤维细胞在两组中均占主导地位，提示它们在FT发病中的核心作用。
3.2. 细胞类型鉴定
标记基因可视化验证了注释准确性，细胞类型比例在患者间存在显著差异，体现了乳腺FT的异质性。上皮细胞显示早期/晚期雌激素反应和氧化磷酸化通路富集，而成纤维细胞富集上皮-间质转化(EMT)和Wnt/β-catenin信号。
3.3. 各细胞类型标记基因表达
气泡图显示特征基因在相应细胞群体中选择性高表达，证实细胞类型注释的可靠性。
3.4. FT各细胞类型GSVA富集分析结果
基因集变异分析(GSVA)显示上皮细胞富含雌激素反应通路，成纤维细胞活跃于EMT和Wnt/β-catenin信号，中性粒细胞激活TNF–NFκB和KRAS信号，展现了FT微环境中协调的代谢和免疫活动。
3.5. FT各细胞类型转录因子分析
调控网络推断显示上皮细胞中TFAP2A和BARX2与雌激素受体调控相关，青少年成纤维细胞特异性表达SKOR1，成人则表达HMGA2、TWIST2和SIX2，表明年龄特异性的转录调控。
3.6. 上皮细胞注释
上皮细胞进一步分为11个亚群，归类为基底细胞、导管1型和导管2型三种亚型。青少年样本含有更多基底细胞，成人则富含导管2型细胞。青少年组的基底和导管2型亚型显示更高的雌激素受体(ER)表达。
3.7. 差异表达基因和GSEA富集分析
差异基因分析显示青少年上皮细胞显著激活PI3K–AKT、MAPK和GnRH信号通路，同时存在内分泌耐药通路，这解释了青少年FT对激素治疗不敏感的现象。基因本体(GO)富集分析显示差异基因显著富集于"激素反应"、"上皮细胞增殖"等通路。
3.8. 上皮细胞伪时间分析
伪时间轨迹显示基底细胞向导管1型和导管2型分化。青少年上皮细胞在早期发育阶段富集"染色体组织调控"和"DNA修复"通路，而成人则富集"细胞周期负调控"等通路，表明不同的成熟轨迹。
3.9. 不同FT组上皮细胞代谢异质性
代谢分析显示青少年上皮细胞具有增强的类固醇生物合成和氨基酸代谢，反映活跃的合成代谢状态；成人上皮细胞则显示更高的三羧酸循环和脂肪酸氧化活性，符合更氧化、分化的代谢特征。
3.10. 成纤维细胞亚群分析
成纤维细胞分为6种亚型：肌成纤维细胞(mCAFs)、炎症相关成纤维细胞(iCAFs)、血管成纤维细胞(vCAFs)、肿瘤相关成纤维细胞(tCAFs)、抗原呈递成纤维细胞(apCAFs)和分裂成纤维细胞(dCAFs)。青少年组中mCAFs和apCAFs比例更高，成人组则以iCAFs为主。
3.11. 成纤维细胞差异基因分析
发现857个上调基因和118个下调基因，血管生成相关基因(MMP16、PTN)下调，而与细胞增殖、应激反应和缺氧相关的基因(KLF4、ATF3、HIF3A)上调，表明FT成纤维细胞向增殖和缺氧状态转变。
3.12. 成纤维细胞差异表达基因的GO富集分析
差异基因显著富集于细胞外基质组织、氧反应等生物过程，以及胶原结合、生长因子结合等分子功能，表明成纤维细胞适应应激和肿瘤发生刺激。
3.13. 各成纤维细胞亚群GSEA通路富集分析
GSVA显示mCAFs富集Hedgehog信号，tCAFs富集EMT和KRAS信号，apCAFs富集IL2–STAT5和IFN-γ通路，vCAFs激活Wnt/β-catenin和氧化磷酸化，dCAFs富集E2F靶点和G2M检查点通路。
3.14. 成纤维细胞GSEA富集分析
GSEA显示青少年成纤维细胞更强激活MAPK、HIF-1和GnRH信号及内分泌耐药通路，表明它们通过MAPK信号和激素刺激在FT发病中起关键作用。
3.15. 成纤维细胞伪时间序列分析
伪时间分析显示青少年成纤维细胞发育轨迹中，mCAFs处于初始状态，apCAFs和vCAFs处于终末状态；而成人组iCAFs处于初始状态，vCAFs和mCAFs处于终末状态。青少年apCAFs标记基因HLA-DRA、CD74随发育逐渐增加，成人组则先增后降，表明年龄特异的抗原呈递功能差异。
3.16. 成人和青少年组组织中不同细胞的通讯
细胞通讯分析显示成人组中apCAFs和dCAFs与其他细胞类型交互更强，青少年组则显示基质细胞与上皮细胞之间更活跃的通讯网络。
3.17. 青少年组和成人组细胞间通讯的变化
比较分析显示青少年组apCAFs、基底细胞和dCAFs交互频率增加，导管2型细胞与其他群体通讯强度更强，表明成纤维细胞和上皮细胞在青少年肿瘤微环境中的独特作用。
3.18. 二维空间中比较主要来源和目标
二维分析显示上皮细胞在青少年和成人组中都是信号的主要发送者和接收者，凸显其在肿瘤-基质通讯中的核心地位。青少年组中RELN、PTN和HGF通路存在显著差异。
3.19. 细胞间配体-受体对
发现青少年组中apCAFs-导管1型、apCAFs-导管2型和iCAFs-导管2型之间存在显著交互，关键配体-受体对包括MDK-NCL、MDK-SDC4和AREG-(EGFR+ERBB2)。成人组中COL1A2-CD44等配体-受体对下调，表明成纤维细胞-上皮细胞交互减少。
该研究通过单细胞精度揭示了青少年乳腺巨大纤维上皮性肿瘤的独特微环境特征，特别是激素非依赖性增殖程序和免疫调节成纤维细胞亚型的关键作用。青少年特异性抗原呈递成纤维细胞的发现，以及PTN-SDC4、MDK-NCL等配体-受体介导的基质-上皮细胞交互网络的解析，不仅深化了对肿瘤生物学的理解，更为开发针对性、微创性治疗策略提供了新思路。这些发现对改善年轻患者预后、避免手术对乳腺发育的影响具有重要临床意义。尽管样本量限制和正常组织对照缺失是本研究的主要局限，但所建立的单细胞图谱为后续机制研究和治疗探索奠定了坚实基础。
