《Biological Control》：Development and validation of a screening method for actinomycetes from
Protaetia brevitarsis larval frass with biocontrol potential
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本研究针对土传病害防治中生物杀菌剂筛选效率低、评估难度大的问题，建立了定量控制盆栽试验（QC-PPT）系统，通过优化栽培装置、生长基质和病原接种方法，实现了花生白绢病菌（Sclerotium rolfsii）侵染的定量评估。从白星花金龟幼虫粪便中分离出7株具有拮抗作用的放线菌，其中菌株X15在QC-PPT系统中使花生根干重增加32.8%，病斑面积减少51.2%。基因组分析显示X15含有最丰富的次级代谢产物合成基因簇。该研究为土传病害绿色防控提供了新方法和高效菌种资源。
在农业生产中，土传病害如同潜伏在地下的"隐形杀手"，通过根系侵染导致作物减产甚至绝收。尤其像花生白绢病这类由齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起的病害，因其发病隐蔽、防治困难，已成为威胁花生产业的重要障碍。传统化学农药虽然能一定程度控制病害，但长期使用会导致土壤生态破坏和病原菌抗药性产生。因此，开发高效、环保的生物防治技术迫在眉睫。
然而，土传病害的生物防治面临着一个关键瓶颈：缺乏可靠的筛选评估体系。由于土壤环境的复杂性，实验室平板拮抗试验的结果往往与田间实际效果存在较大差距。这就好比"纸上谈兵"与"实战演练"的区别，许多在平板上表现优异的菌株，在实际土壤环境中可能因无法定殖或代谢产物表达不足而失效。为了解决这一难题，研究人员开展了一项创新性研究，旨在建立一套能真实模拟土壤环境、可定量评估的生防菌筛选体系。
这项发表于《Biological Control》的研究，以花生-白绢病菌为模型系统，开发了定量控制盆栽试验（QC-PPT）系统。研究人员首先对栽培装置进行精心设计，采用100毫升离心管作为栽培容器，通过在管底开设1毫米×2厘米的狭缝保证通气排水，在侧壁5.5厘米高处开设6-8毫米的接种孔。这种设计巧妙利用了植物的"趋壁生长"特性，使花生侧根在10-13天内紧密贴附管壁分布，为病原菌均匀侵染创造了条件。
在基质优化方面，研究团队发现添加4%有机堆肥的蛭石基质既能保证花生正常生长，又能维持足够的病原菌侵染强度。通过系统测定花生生长周期，确定在栽培第10-16天进行病原接种，第28天取样评估是最佳时间窗口。这一系列优化使得QC-PPT系统能够准确模拟自然土壤环境中的病原菌-植物互作。
利用这一创新系统，研究人员从白星花金龟（Protaetia brevitarsis）幼虫粪便中分离到100株放线菌，其中7株对白绢病菌显示出拮抗活性。令人惊讶的是，平板对峙试验中抑菌率最高（44.56%）的X13菌株，在QC-PPT系统中的实际防效并非最佳。相反，X15菌株表现出最全面的生防效果：不仅使花生根干重显著增加32.8%，还将根病斑面积降低51.2%。这一发现凸显了QC-PPT系统在筛选实用型生防菌株方面的独特价值。
基因组测序结果进一步揭示了X15菌株的优越性。该菌株含有16个预测的次级代谢产物生物合成基因簇，包括弗雷德里卡霉素（fredericamycin）、抗霉素（antimycin）、坎地辛（candicidin）等具有已知抗菌活性的化合物合成基因。此外，X15特有的TRP1（色氨酸合成相关）、tam/tamB（IAA生物合成相关）和ahpF（过氧化物酶活性相关）基因可能与其促进植物生长和诱导抗性能力密切相关。
本研究建立QC-PPT系统主要采用以下关键技术方法：利用改良离心管装置实现根系空间限制和病原精准接种；通过蛭石与有机堆肥配比优化调控病原侵染强度；基于图像分析软件（ImageJ）定量评估根病斑面积；采用白星花金龟幼虫粪便特异性培养基分离放线菌；结合全基因组测序和antiSMASH分析次级代谢产物基因簇。研究样本中的白绢病菌分离自河北省染病花生根，白星花金龟幼虫粪便为实验室饲养收集。
3.1 QC-PPT系统的建立与优化
通过优化栽培装置，发现100毫升离心管能诱导花生根系贴壁生长，为中孔接种病原菌创造条件。确定1毫米×2厘米底缝可防止基质流失且不影响根系测量。比较不同接种位点显示中孔接种可实现根系均匀侵染。
3.1.2 花生生长周期与病原接种时间确定
系统监测花生生理参数发现，栽培10天后侧根已贴壁生长，16天内各项生长指标趋于稳定，因此确定10-16天为最佳接种窗口期，28天为理想评估时间。
3.1.3 不同栽培基质对植物生长和病原侵染的影响
添加4%有机堆肥的基质在支持花生正常生长的同时，能维持足够的病原侵染强度，而8%有机堆肥则显著抑制病原菌生长，不利于生防效果评估。
3.2 具有生防特性放线菌的分离鉴定
从幼虫粪便中分离的7株放线菌均对白绢病菌有抑制作用，X13菌株平板抑菌率最高达44.56%。系统发育分析显示6株为白色链霉菌（Streptomyces albidoflavus），1株为白色拟诺卡氏菌（Nocardiopsis alba）。
3.3 放线菌对植物抗病效果的分析
QC-PPT评估显示X14菌株降低病斑面积效果最佳，X15菌株在提高根干重（32.8%）和减少病斑面积（51.2%）方面综合表现最优，且灭菌粪便本身也具一定促生作用。
3.4 活性放线菌基因组分析
X15菌株含有最丰富的次级代谢产物合成基因簇，包括多种抗菌化合物合成途径，这与其卓越的生防性能相吻合。
研究结论表明，QC-PPT系统能有效桥接实验室与田间试验的差距，实现生防菌株的高通量、定量化筛选。从白星花金龟幼虫粪便中获得的X15放线菌株是一个极具开发潜力的生防资源，其丰富的次级代谢产物基因库为新型生物农药研发提供了重要基础。该研究不仅为花生白绢病的绿色防控提供了具体解决方案，更重要的是建立了一套可推广到其他作物-土传病害系统的生防菌筛选平台，对推动农业可持续发展具有重要意义。
讨论部分进一步强调，土壤环境的模拟精度是生防菌筛选成功的关键。有机堆肥的添加量需要精确控制，既能模拟真实土壤微环境，又要保持足够的病害压力用于效果评估。放线菌作为土壤中的天然优势菌群，其资源开发远未充分。本研究通过将昆虫肠道微生物资源与创新筛选方法相结合，为土传病害防控开辟了新途径。X15菌株的多重抗病机制（抗菌物质产生、生长促进和抗性诱导）使其成为一个理想的生物防治候选菌株，有望在未来成为化学农药的有效替代品。
