《Cell Biomaterials》：Sustained bioactivity of nucleic acid-encoded EPO- and NGF-functionalized conduits enhances regeneration in long-gap peripheral nerve injuries
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本研究针对长节段周围神经损伤缺乏有效替代自体神经移植方案的临床难题，开发了搭载促红细胞生成素(EPO)和神经生长因子(NGF)编码质粒的胶原基神经导管。通过体外优化EPO:NGF基因比例为1:5(1E5N)，该导管在大鼠15mm坐骨神经缺损模型中显著加速轴突再生、髓鞘重塑和肌肉神经支配恢复，功能恢复接近自体移植水平。转录组与细胞因子分析表明1E5N导管可重建自体移植特有的再生信号通路，抑制炎症并促进促再生巨噬细胞表型。该基因激活导管为长节段周围神经修复提供了可规模化、机制明确的治疗策略。
周围神经损伤是全球性的临床挑战，尤其当神经缺损超过10毫米时，轴突难以跨越损伤间隙，导致患者运动感觉功能永久丧失。目前临床金标准是自体神经移植，但来源有限且会造成供区并发症。虽然FDA已批准胶原导管用于短节段损伤（<3厘米），但对长节段缺损效果欠佳，关键在于缺乏持续有效的促再生信号激活。
为此，高威大学CúRAM医学设备研究中心的Secil Demir等人在《Cell Biomaterials》发表研究，开发了一种核酸编码的胶原神经导管，可局部持续表达促红细胞生成素(EPO)和神经生长因子(NGF)，显著增强长节段周围神经再生。研究通过蛋白质组学分析发现，传统胶原导管无法激活PI3K/Akt、细胞骨架重塑等关键再生通路，而EPO（通过EPOR-JAK2-STAT5通路）和NGF（通过TrkA-PI3K/ERK通路）可协同靶向这些缺陷。团队通过体外剂量筛选确定1:5的EPO:NGF基因比例(1E5N)能最优促进背根神经节(DRG)神经元兴奋性和钙信号。在15毫米大鼠坐骨神经缺损模型中，双基因导管加速了轴突再生、髓鞘形成和肌肉神经再支配，功能恢复接近自体移植。
研究主要采用以下关键技术：通过挤压法制备质粒嵌入的胶原纤维并组装成导管；利用背根神经节(DRG)培养模型进行基因比例优化和钙成像/微电极阵列分析；建立大鼠15毫米坐骨神经缺损模型进行体内评估；通过体视荧光成像(IVIS)、免疫荧光、透射电镜(TEM)和步态分析等多维度评价再生效果；采用RNA测序(RNA-seq)和细胞因子阵列进行分子机制解析。
研究结果如下：
设计、制备和体外表征基因递送胶原导管
研究人员通过挤压法制备了携带EPO或NGF编码质粒的胶原基神经导管。扫描电镜(SEM)显示导管壁厚约200微米，内外径分别为1.5毫米和1.9毫米，在生理条件下仅轻微膨胀（长度增加2%），表明结构稳定。EDC交联使导管拉伸强度提高500%。Cy5标记的GFP质粒验证了导管可支持持续基因递送和轴突生长。
再生信号在胶原导管中相较于自体移植被破坏
植入后2周的蛋白质组学分析显示，自体移植激活了PI3K/Akt、JAK/STAT等再生通路，而胶原导管则呈现应激反应特征。上游调控因子如AKT1、STAT3、VEGFA等在自体移植中激活，在导管中则被抑制，这提示了NGF和EPO靶向这些通路的必要性。
EPO和NGF协同增强神经元活性和钙信号
在DRG培养中，1:5 EPO:NGF比例(1E5N)显著增强神经元兴奋性和钙信号，钙活性增加2.66倍，信号持续时间增加3.69倍。微电极阵列(MEA)记录显示1E5N处理组峰值振幅显著提高，表明双基因协同作用最优。
胶原导管实现局部持续体内基因递送
在大鼠坐骨神经15毫米缺损模型中，植入后7天导管结构完整。IVIS成像显示Cy5标记的GFP质粒组荧光信号显著高于对照组，免疫荧光证实质粒被细胞内化并表达，表明导管可实现局部持续基因递送。
巨噬细胞极化和细胞因子谱的调节揭示差异性的炎症和再生特征
植入后2周免疫荧光显示，自体移植和1E5N组M2/M1巨噬细胞比率最高，表明促再生免疫表型。细胞因子分析显示1E5N组促炎因子（如TNF-α、IL-6）被抑制，而再生相关因子（如VEGF、IL-13）上调。通路富集分析显示Rap1、Ras、PI3K/Akt等通路在1E5N组最活跃。
转录组分析揭示治疗特异性分子特征和通路富集
RNA测序(RNA-seq)显示，1E5N组转录谱最接近自体移植，差异表达基因(DEGs)数量最少。KEGG分析表明1E5N富集于PI3K-Akt、ERK/MAPK、髓鞘形成等再生通路。基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定出一个髓鞘形成相关模块，在1E5N组中高度激活。
基因治疗后的长期结构、功能和电生理恢复
植入16周后透射电镜(TEM)分析显示，1E5N导管在髓鞘纤维(MF)密度上显著高于单基因组，尽管EPO单独处理在g-比值和髓鞘厚度上最优，但1E5N平衡了髓鞘质量和轴突数量。步态分析和电生理记录表明1E5N组在踝关节角度、力-时间积分(FTI)、神经传导速度(NCV)和复合肌肉动作电位(CMAP)振幅上恢复最佳，接近自体移植水平。
研究结论表明，核酸编码的EPO和NGF功能化胶原导管通过持续局部表达治疗因子，协同激活PI3K/Akt和ERK依赖通路，有效克服了传统导管生物活性不足的问题。在15毫米临界尺寸神经缺损中，双基因递送（尤其1E5N比例）在轴突再生、髓鞘形成、免疫调节和功能恢复方面均接近自体移植效果。该策略将结构支架与持续基因递送相结合，为长节段周围神经修复提供了可临床转化的替代方案。
