《Developmental Biology》：Vnd and En are expressed in orthogonal stripes and act in a brief competence window to combinatorially specify NB7-1 and its early lineage
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果蝇胚胎中空间转录因子En和Vnd通过组合作用特异性标记神经前体细胞NB7-1，并鉴定其特异性表达基因fd4。
Nathan L.Q. Anderson | Sen-Lin Lai | Chris Q. Doe
俄勒冈大学霍华德·休斯医学研究所神经科学研究所，尤金，OR 97403
摘要
理解神经元多样性的产生机制是神经科学的重要目标。在这里，我们描述了在果蝇胚胎中产生神经元多样性的第一步：空间转录因子（STFs）在神经前体的正交行和列中表达。这些因子赋予神经前体（神经母细胞，NBs）空间身份，并且在哺乳动物中高度保守。我们研究了Engrailed（En+；后列）和Vnd+（中列）在指定特征明确的神经前体——神经母细胞7-1（NB7-1）中的作用。我们发现NB7-1位于Vnd和En的交界处，并通过一种新鉴定的基因fd4来识别NB7-1，该基因在NB7-1及其后代中特异性表达，从而为我们提供了识别NB7-1的具体方法。我们证明En和Vnd都对于Fd4的表达是必需的，而Vnd和En的共同表达足以在其他神经母细胞及其谱系中诱导Fd4的异位表达。最后，我们发现神经母细胞逐渐失去了对En或Vnd的反应能力。我们得出结论，En和Vnd是通过组合方式来指定单个前体NB7-1的身份的空间转录因子。
引言
神经元多样性对于正确的电路形成和行为至关重要。了解神经元多样性的产生机制有助于阐明电路组装的机制，并有助于设计更有效的神经重编程方法，以治疗脑损伤和疾病。在哺乳动物和果蝇中，产生神经元多样性有两个主要步骤：空间模式化和时间模式化（Sagner等人，2021年；Skeath和Thor，2003年）。在这里，我们关注空间模式化。
在哺乳动物中，空间模式化创造了分子上不同的神经干细胞（NSCs）池，这在脊髓中最为明显。在这里，Bmp（背侧高浓度）和Sonic hedgehog（Shh；腹侧高浓度）的相反梯度生成了11种分子上不同的前体池，这些前体致力于生成不同类型的神经元和胶质细胞（Briscoe等人，2000年；Sagner等人，2021年）。
在果蝇中，空间模式化也产生了前体多样性，这在腹侧神经索（VNC）中最为明显，其结构类似于脊髓（Skeath和Thor，2003年）。神经外胚层表达促进新生前体（果蝇中的神经母细胞，NBs）分层的基因（Skeath等人，1994年；Skeath和Carroll，1992年）。每个半段的最初10个神经母细胞排列成行（1、3、5、7）和列（腹侧、中间、背侧）（见图1F）。随后会添加更多的行和列。在行或列中表达的基因被称为“空间转录因子（STFs）”，当它们对于指定行或列内的神经母细胞是必需的时候（Chu等人，1998年；McDonald等人，1998年；Weiss等人，1998年），而其他行和列的因子被称为候选STFs。到目前为止，已有三种柱状STFs：Ventral nervous system defective（Vnd）、Intermediate nervous system defective（Ind）和Muscle segment homeobox（Msh；Flybase：Drop）（Chu等人，1998年；McDonald等人，1998年；Weiss等人，1998年）。事实上，先前的研究表明，每种柱状TF都负责指定VNC内的“柱状身份”；例如，Vnd因子的错误表达可以将中间柱特异性的分子标记转化为腹侧柱的标记（Chu等人，1998年；McDonald等人，1998年），而Ind因子的错误表达可以将侧列转化为扩展的中间柱（Weiss等人，1998年）。这些柱状STFs在哺乳动物中高度保守，它们的同源物（Nkx2.2、Gsx和Msx）也在脊髓的相邻列中表达（Weiss等人，1998年）。
同样，几个行空间因子对于指定新生神经母细胞的“行身份”是必要且充分的：第5行中Wingless信号配体的表达对于形成和指定相邻第4行和第6行的神经母细胞是必需的（Chu-LaGraff和Doe，1993年），而Gsb对于指定第5行的身份是必要且充分的（Bhat，1996年；Skeath等人，1995年）。还有一些候选STFs：从前向后依次为Mirror和Engrailed（En）（Chu-LaGraff和Doe，1993年；O’Farrell等人，1985年；Skeath等人，1995年）。
这些研究确立了通过正交表达的同源结构域STFs进行空间模式化的概念，但仍有许多未解之谜。是否存在比迄今为止已鉴定的更多的STFs？行和列STFs是否以组合方式来指定一个或几个前体？前体何时会失去对空间模式化基因的反应能力？在这里，我们使用新的神经母细胞和谱系标记来回答所有这些问题。
章节片段
果蝇品系
果蝇在25°C的培养箱中维持。染色体和转基因的插入位点（如果已知）显示在基因型旁边。使用了以下果蝇品系：en-gal4（Schmid等人，1999年），grainy head (grn)-gal4（RRID:BDSC_76172），NB7-1-gal4KZ（II），称为NB7-1-gal4（Seroka和Doe，2019年），scabrous (sca)-gal4（Cheesman等人，2004年），vnd-T2A-gal4（称为vnd-gal4；本研究），worniu (wor)-gal4（Albertson和Doe，2003年），10xUAS-IVS-myr::sfGFP（UAS-Gfp）（RRID:BDSC_62127），UAS-lacZ
fd4在NB7-1及其谱系中特异性表达
为了探索神经母细胞如何建立和保持其独特身份的机制，我们重点研究了NB7-1。我们之前生成了一个单细胞RNA测序文库，其中包含了NB7-1谱系和其他神经母细胞谱系（Seroka等人，2022年）。我们鉴定出基因fd4（FlyBase：fd96Ca）是NB7-1谱系中富集最明显的转录因子（图1A），这表明Fd4可能具有NB7-1特异性的表达和功能。fd4 RNA在一段重复的细胞簇中表达
讨论
在这项工作中，我们使用叉头结构域转录因子Fd4（Flybase: fd96Ca）作为NB7-1及其后代的标记。在中枢神经系统中，Fd4特异性地检测到在NB7-1及其谱系中，尽管它在腿部想象盘（Heing?rd等人，2019年；Ruiz-Losada等人，2021年）、胚胎周围神经系统（H?cker等人，1992年）和胚胎内脏中胚层（Zhu等人，2012年）中也有所表达。Fd4的详细表达和功能分析将在后续研究中进一步进行
CRediT作者贡献声明
Sen-Lin Lai：写作——审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。Nathan L.Q. Anderson：写作——审阅与编辑、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。Chris Q Doe：写作——审阅与编辑、初稿撰写、监督、资源管理、项目管理、资金获取、数据管理
资助
这项工作得到了HHMI（CQD，SLL）和ARCS奖学金以及NIH T32-HD07348（NQA）的资助。
致谢
我们感谢Tom Kornberg和Judith Kassis提供的UAS-en果蝇，Dervla Mellerick提供的UAS-vnd果蝇，以及Keiko Hirono制作的vnd-T2A-gal4果蝇。我们感谢Kasey Drake、Derek Epiney和Keiko Hirono对手稿的评论。本研究中使用了来自NIH NICHD创建并由爱荷华大学生物系维护的发育研究杂交瘤库的抗体。果蝇品系来自Bloomington Drosophila Stock Center（NIH P
