《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Ocular surface microbiota alterations in patients with pterygium
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本研究通过16S rRNA测序技术，首次揭示翼状胬肉（Pterygium）患者眼表菌群存在特异性改变，表现为机会致病菌（如Pseudomonas）相对丰度显著增加，而有益菌（如Bacteroides）减少。研究发现长时间（≥4 h/d）使用电子设备可导致患眼菌群多样性（Chao1/Shannon指数）显著升高，提示蓝光暴露可能通过改变眼表微环境促进翼状胬肉发展，为理解其发病机制提供了新的微生物学视角。
引言
翼状胬肉是一种高流行的结膜疾病，以慢性退行性炎性病变为特征，表现为由结膜上皮和增殖性结膜下组织构成的三角形纤维血管增生。该病变通常起源于睑裂鼻侧并向角膜表面延伸。临床上，翼状胬肉常伴有眼红、刺激和干涩症状，严重者病变侵入瞳孔区可导致视力损害。紫外线辐射、病毒感染和衰老已被认为是关键风险因素。手术切除是主要治疗方式，但术后复发构成重大临床挑战。随着人体微生物组研究的进展，眼表微生物群在健康与疾病中的潜在作用逐渐受到关注。已有研究证实眼表微生物群与睑缘炎、睑板腺功能障碍、角膜炎和干眼症等疾病相关，但针对翼状胬肉患者眼表微生物群的研究仍有限，且微生物群改变与翼状胬肉发展之间的关联尚未完全阐明。鉴于微生物组在维持眼部免疫稳态中的关键调节作用，本研究旨在评估翼状胬肉患者的眼表微生物群，利用16S rRNA测序分析患眼与对侧健眼的微生物组成和多样性，以表征眼表微生物群的定植模式。
方法与材料
本研究遵循《赫尔辛基宣言》原则，所有参与者均签署书面知情同意书，研究方案经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准（MR-23-25-075763）。
参与者
研究招募了2023年11月至2024年2月期间就诊于哈尔滨医科大学附属第一医院眼科的31例单侧原发性翼状胬肉患者。收集每位患者的详细病史后进行一系列眼科检查。根据评估结果，患者被分为翼状胬肉患眼组（PE组，包含所有31例患者的患眼）和对侧健眼组（CE组，包含26例参与者的对侧健眼）。纳入标准为确诊的单侧原发性翼状胬肉。排除标准包括：近一个月内有急性眼部炎症；近三个月内接受过全身抗生素治疗；近一个月内使用过可能影响眼表微生物群的药物（如抗生素或皮质类固醇）；患有影响免疫功能或眼部健康的全身性疾病。
样本收集
使用一次性无菌干拭子从每位患者的结膜采集微生物样本。拭子以均匀压力在下方球结膜上轻柔移动2–3次。每次采集后使用无菌拭子作为空白对照，以确保样本质量和可靠性。拭子置于无菌容器中，冰上运输至实验室，并储存于-80°C以待DNA提取和分析。所有样本均由同一位眼科医生在紫外线消毒的眼科检查室中采集，操作者佩戴无菌口罩和手套。双眼采用相同的采样程序以保证一致性。
DNA提取与扩增
使用MagPure Soil DNA LQ Kit按照制造商说明从采集的样本中提取基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000分光光度计评估提取DNA的浓度和纯度。纯化后的DNA保存于-20°C直至后续使用。以提取的DNA为模板，使用带特异性条形码的引物和Takara Ex Taq高保真DNA聚合酶对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增。为分析细菌多样性，使用通用引物343F（5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’）和798R（5’-AGGGTATCTAATCCT-3’）扩增16S rRNA基因的V3–V4可变区。
文库制备与测序
通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR扩增产物。使用AMPure XP磁珠纯化扩增子，并作为后续PCR扩增循环的模板。经磁珠二次纯化后，使用Qubit荧光计对纯化的PCR产物进行定量，并调整浓度以备测序。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，生成250 bp双末端读长。所有测序程序由上海欧易生物技术有限公司完成。
生物信息学分析
数据处理、测序和文库构建由上海欧易生物技术有限公司完成。原始测序数据以FASTQ格式生成。使用Cutadapt程序从原始数据中去除引物序列。合格的配对末端读长随后使用QIIME2中的DADA2插件进行质量过滤、去噪、合并和嵌合体去除，以获得代表性序列和扩增子序列变异（ASV）丰度表。利用QIIME2流程为每个ASV选择代表性序列，并使用q2-feature-classifier插件对照SILVA数据库（版本138）进行物种分类。使用Chao1和Shannon指数评估Alpha多样性。使用R软件进行主坐标分析（PCoA）以评估样本间差异，并使用非加权UniFrac距离矩阵确定Beta多样性。使用线性判别分析效应大小（LEfSe）软件（版本1.0）基于线性判别分析（LDA）得分>2识别潜在的微生物生物标志物。
统计分析
使用SPSS软件（版本23.0）进行统计分析。分类数据以比例表示，连续变量以均值±标准差表示。两组间微生物属水平差异采用t检验分析。使用Mann–Whitney U检验和单因素方差分析确定组间差异。基于距离矩阵的置换多元方差分析也用于确定组间群落结构的显著差异。统计学显著性设定为p < 0.05。
结果
患者特征与测序质量控制
31例单侧翼状胬肉患者受邀参与研究。表1总结了其人口学特征。年龄范围36至76岁，平均58.6 ± 9.4岁。女性17例（54.8%），男性14例（45.2%）。翼状胬肉患眼的平均泪膜破裂时间（TBUT）（8.0 ± 1.8秒）显著低于对侧健眼（10.7 ± 1.9秒）（P < 0.001；表2）。16S rRNA测序每个样本产生78,015–81,955条原始读长。质控后清洁标签数量为68,463–76,672。去除嵌合体后的有效标签数量为65,109–76,272。每个样本的ASV数量范围为76至252。维恩图分析显示PE组和CE组分别有1,811和1,438个独特ASV，共享439个ASV（图1A）。PE组和CE组的ASV存在显著差异（精确二项检验，p < 2.2×10-16；图1B）。
物种注释分析
对ASV序列进行物种注释，以评估翼状胬肉患眼与对侧健眼之间眼表微生物组成的差异。共鉴定出24个细菌门和395个属。在门水平，Proteobacteria、Bacteroidota、Firmicutes和Actinobacteriota在两组微生物群落中占主导地位，占总相对丰度的80%以上（图1C）。Proteobacteria的相对丰度在PE组（76.14%）略高于CE组（70.57%），而Bacteroidota的相对丰度在PE组（9.54%）低于CE组（14.20%），但这些差异无统计学显著性（Bacteroidota：p = 0.07；Proteobacteria：p = 0.13）。Firmicutes和Actinobacteria在CE组的相对丰度分别为10.84%和2.82%，在PE组分别为8.08%和3.95%，组间分布具有可比性。在属水平，两组中最普遍的类群是Citrobacter、Pelomonas和Pseudomonas，在PE组和CE组中分别占总相对丰度的55.40%和48.94%（图1D）。
PE组与CE组眼表微生物群分析
Alpha多样性反映了样本内微生物群落的丰富度和均匀度。使用Chao1和Shannon指数评估两组样本的丰富度和均匀度。数据显示两组间Alpha多样性无显著差异，表明PE组和CE组具有相当的微生物丰富度和均匀度（图2A）。物种积累箱线图显示，观察到的ASV数量随着样本量的增加而稳步增加，并趋于平稳，表明样本量足以捕获数据集中的大部分微生物多样性（图2B）。稀疏曲线同样趋于平缓，表明测序深度充足，物种覆盖度令人满意，更多的数据不会显著影响Alpha多样性指数（图2C）。Beta多样性分析如图2D所示，揭示了组间微生物群落结构的差异。结果显示组间无显著差异（R2 = 0.0152, p = 0.832），表明眼表微生物群谱相似，这可能与样本的配对性质有关。LEfSe分析识别出与翼状胬肉患眼和对侧健眼相关的潜在微生物生物标志物。LDA得分分布直方图显示两组间存在18个显著不同的生物标志物（LDA得分 > 2, p < 0.05）。四个属——Brevibacterium、Anaerococcus、Bdellovibrio和Sphingomonas——在PE组中显著富集，而Bacteroides和Helicobacter在CE组中显著富集（图2E）。属水平差异如图2F和图3A所示，Bacteroides和Lachnospiraceae在CE组富集，而Pseudomonas和Ureaplasma在PE组富集（图3B）。
基于电子设备使用时长的翼状胬肉患者眼表微生物群分析
为探究电子设备使用时长对翼状胬肉患者眼表微生物群的影响，参与者被分为四组：PEH4组（翼状胬肉患眼，使用时长≥4小时/天）、CEH4组（对侧健眼，使用时长≥4小时/天）、PEL4组（翼状胬肉患眼，使用时长<4小时/天）和CEL4组（对侧健眼，使用时长<4小时/天）。Alpha多样性分析显示，PEH4组的Chao1和Shannon指数显著高于其对应的CEH4组（图4A），表明长时间使用电子设备与翼状胬肉患眼微生物多样性增加相关。Beta多样性分析显示四组间微生物群落结构存在显著差异（PERMANOVA, p = 0.001；图4B）。进行LEfSe分析以进一步评估电子设备使用时长对翼状胬肉患者潜在微生物生物标志物的影响。八个属，包括Tepidimonas、Paenibacillus、Anoxybacillus、Actinomyces、Ileibacterium、Shewanella和Pseudohongiella，在PEH4组中显著富集。一个属，Romboutsia，在CEH4组中显著富集（图4C）。此外，属水平差异如图4D和图5A所示，Comamonas的相对丰度在PEH4组中显著高于CEH4组（图5B）。
讨论
微生物组是眼表微环境的重要组成部分，受宿主因素、环境暴露和医源性干预的影响，在局部和全身免疫反应中扮演关键角色。眼表微生物群通过破坏免疫稳态、改变局部免疫功能和引起慢性炎症参与眼部疾病的发生。本研究检测了翼状胬肉患眼和对侧健眼的眼表微生物群。Proteobacteria、Bacteroidota、Firmicutes和Actinobacteriota占两组结膜微生物样本中检测到的大部分ASV，这与先前眼表微生物群研究的发现一致，表明本研究观察到的微生物组成具有典型性。
翼状胬肉患眼与对侧健眼在整体眼表微生物多样性上未观察到统计学显著差异。然而，电子设备使用时间较长的翼状胬肉患眼表现出显著高于对侧健眼的微生物丰富度。这些发现提示长时间使用电子设备可能是翼状胬肉发展的潜在风险因素。蓝光存在于许多人造光源中，包括手机、电脑、平板电脑和电视等电子设备的屏幕。蓝光在可见光谱中能量相对较高，其波长范围接近紫外线辐射，而紫外线是翼状胬肉的明确风险因素。尽管个体的双眼通常暴露于相似水平的紫外线辐射，但翼状胬肉常单侧发生。先前研究已明确证实紫外线暴露对眼表的有害影响。据报道，紫外线辐射可调节眼表微生物群并改变抗菌肽表达，从而破坏微生物组与眼表免疫之间的健康平衡，促进慢性眼表炎症。研究也表明蓝光暴露可诱导结膜上皮细胞发生上皮-间质转化（EMT），促进胶原沉积并增强细胞迁移。EMT和胶原沉积是推动病变进展和角膜侵犯的关键机制。翼状胬肉是一种以角膜侵犯和胶原沉积为特征的结膜退行性疾病。结膜组织的变性和功能障碍构成该疾病的病理基础。在本研究中，电子设备使用时间较长的翼状胬肉患眼中Comamonas的相对丰度增加。Comamonas主要来源于自然环境，如水生栖息地和土壤，被认为是一种机会性人类病原体，已有由Comamonas acidovorans引起角膜感染的病例报道。Comamonas属的毒力因子高度多样。蓝光暴露可能改变眼表微环境，从而为Comamonas定植创造有利条件。这些发现表明，过度的蓝光暴露可能通过引起眼表菌群失调和随后的慢性炎症，促进翼状胬肉的发病机制和进展。
近期研究报道眼表菌群失调与翼状胬肉发病机制密切相关。本研究中，翼状胬肉患眼Pseudomonas的相对丰度显著较高，而Bacteroides的相对丰度显著较低。先前研究已在翼状胬肉患者的穹窿和结膜组织样本中检测到Pseudomonas，这与我们的发现一致，支持了其可靠性。Pseudomonas是一种与炎症密切相关的机会致病菌，具有灵活的代谢能力，使其能够在多样化的环境生态位中定植。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可引起严重的角膜疾病。该菌形成的生物膜及其分泌的各种毒力因子（如弹性蛋白酶和外毒素A）在其致病性中起关键作用。本研究中，翼状胬肉患眼的泪膜破裂时间显著缩短。先前研究报道了翼状胬肉形成与泪膜稳定性降低之间的关联，提示泪膜功能障碍可能参与疾病发展。眼表泪膜含有多种物质，如生长因子、抗菌肽、分泌型IgA和维生素，通过支持免疫稳态和宿主防御来维持眼表健康。因此，翼状胬肉患眼中机会致病菌定植增加可能归因于泪膜稳定性受损，后者削弱了眼表免疫屏障并改变了眼表炎症状态，从而促进疾病进展。Bacteroides物种很少通过常规培养方法在眼表检测到。Bacteroides是人体盲肠和结肠中常见的革兰氏阴性厌氧菌，在维持肠道屏障完整性中起关键作用。其在眼表丰度的降低可能反映了局部防御能力的减弱。本研究中观察到的非 resident细菌在眼表的定植可能与粘膜损伤以及随后Bacteroides通过受损粘膜渗透到粘膜下组织并引起感染有关。总之，翼状胬肉患眼的眼表菌群失调可能促进慢性炎症，并参与疾病的发生和进展。益生菌已被提出作为调节眼表免疫和缓解慢性眼部炎症的潜在策略。未来的研究可能侧重于局部应用抗菌肽滴眼液和减少电子设备使用时间，以抑制机会致病菌的过度生长。这些策略可能有助于改善眼表微生物群组成和泪膜功能，并对预防和管理翼状胬肉及其他眼表免疫炎症性疾病有所贡献。
本研究存在若干局限性。首先，样本量相对较小，可能限制研究结果的普适性，需要更大规模的队列研究加以验证。其次，本研究仅关注翼状胬肉患者眼表的细菌群落，未评估其他微生物群体（如真菌或病毒），限制了对眼表微生态的全面表征。此外，功能预测有限，难以阐明所识别微生物的代谢潜力和潜在致病机制。未来采用宏基因组测序的研究可能解决这些局限性，为眼表微生物组与翼状胬肉的关系提供更全面的见解。最后，由于是单中心研究，地区和人群特异性因素可能影响结果，需要进行涉及不同人群的多中心研究以确认这些发现的可信度和可重复性。
结论
确诊为翼状胬肉的患者表现出明显的眼表细菌定植改变，其特征是机会致病菌丰度增加。电子设备使用时长影响了这些患者眼表微生物多样性。长时间暴露于电子设备发出的蓝光可能代表翼状胬肉的一个潜在风险因素，为其发病机制提供了新的理论见解。
